peg6000沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病毒

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1、PEG6000沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病毒文章来源：　　　　2006-7-1818:54:14 PEG6000沉淀结合差速离心方法浓缩水中脊髓灰质炎病毒　　第四军医大学学报2000年第21卷第1期张文清　马文煜　骆文静　姜绍谆　胡艳冰　侯悦　张进　于碧云　　摘　要：目的　建立一种简便、有效的从细胞培养物中纯化PV1病毒的方法用于水病毒消毒实验.方法　PV1Henan株在Hep-2细胞中增殖后用聚乙二醇(PEG)6000沉淀结合差速离心的方法纯化病毒.rT-PCR和透射电镜(TEM)鉴定提纯病毒的形态学和分子生

2、物学特性.结果　pH值7.5时终浓度70g·L-1的PEG6000沉淀病毒的感染性回收率(PFU计数)为79.2%，提纯系数(PF)为106，再经差速离心(16000g30min，100000g4.5h)浓缩病毒的感染性回性率和提纯系数分别为29.0%和168.rT-PCR和TEM最终鉴定提纯物为PV1Henan株.结论　PEG6000结合差速离心的方法较之蔗糖密度梯度区带离心方法易于操作，且比单独PEG沉淀有更高的纯化系数，是一种简便、有效的方法.　　关键词：脊髓灰质炎病毒；病毒分离与纯化；聚乙二醇；离心法　　0　引言　

3、　影响水中病毒消毒效果的因素很多，除了病毒的生物学特性、消毒剂的性质与剂量以及环境温度外,还有水中病毒聚集性、水质酸碱度、离子强度以及病毒周围有机物等［1］.包绕在病毒周围的有机物，尤其是蛋白类，不仅为病毒提供物理屏障，使消毒剂不易穿透至作用靶点，而且有机物中许多化学基团如巯基还可与氧化性消毒剂产生反应，导致消毒剂有效浓度大为降低.emetson等［2］报告，臭氧灭活Hep-2.细胞中的PV和Coxs病毒需要的消毒剂浓时积(CT值)较灭活游离于细胞外的这两种病毒高约150倍,因此在人工制备病毒污染水样时要经过反复冻融感染细

4、胞、超声粉碎、低速离心沉淀细胞碎片以及其它特殊沉淀病毒蛋白、离心提纯病毒的过程.我们采用反复冻融、超声粉碎、低速离心以去除细胞碎片,并进一步用PEG6000沉淀病毒蛋白、差速离心提纯PV1病毒.　　1　材料和方法　　1.1　材料　电子显微镜，JEM-2000EX型，日本电子公司；高速冷冻离心机GL-20A型，湘西仪器仪表厂；超速离心机，Centrikont-2080型，瑞士Kontron公司.病毒株与细胞株［3］，PEG6000，日本进口，天津天秦公司分装.　　1.2　方法　细胞培养与病毒感染按我们先前的方法［3］.接种病

5、毒3～5d出现严重CPE（＞）后反复冻融细胞5～6次，再经超声粉碎至细胞完全裂解.病毒原液（S0）在4℃环境经4000r·min-1离心30min后弃沉淀(P1)，留上清(S1)冻存备用.PEG沉淀：在S1中缓慢滴加400g·L-1PEG6000溶液至PEG终浓度为70g·L-1，并随时搅拌、调整pH至7.5.4℃过夜后，8000r·min-1离心30min后弃上清(S2)，留沉淀(P2).差速离心：用0.01mol·L-1pH7.4的PBS混悬P2后4℃12000r·min-1(16000g)离心30min后弃沉淀(P

6、3)，上清(S3)再经PBS混悬，4℃38000r·min-1(100000g)超速离心4.5h弃上清(S4)，沉淀(P4)混悬后冰浴条件下14mm振幅超声粉碎2min，加双抗处理后用灭菌双蒸去离子水稀释，-75℃冻存.蛋白质浓度测定：按Lowry方法.病毒感染性测定：采用改良的蚀斑试验［3］.RT-PCR：详见我们先前的实验［4］.　　TEM鉴定：30mL·L-1戊二醛和10g·L-1饿酸双固定P4中病毒，按常规电镜制作程序用Epon812,dDSA,DMP-30混合液制备包埋块，超薄切片后用醋酸铀和枸橡酸铝染色，透射电

7、镜下观察照相.　　2　结果　　2.1　细胞培养物处理效果　细胞冻融、粉碎后低速离心可去除绝大部分细胞碎片(P1)，由Tab1可见，离心降低25%的蛋白，但病毒的感染性仅下降15.8%.表1　从细胞培养物中提纯PV1病毒结果　　tab1　TheresultsofpurificationofPV1fromcellculturesSample　　(No)V/mLProteinVirusinfectivityg·L-1%RecoveryPFU/L%RecoveryPFU/gPFaS016006.24100.002.80×10810

8、0.00.49×1081.00S115844.7375.002.38×10884.20.50×1081.01P1Discarded------S2Discarded2.80-5.54×106---P240b1.710.698.87×10979.25.19×109106.00S3380.870.335.0