玉米根须早期发育有关microrna及靶基因之鉴别

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1、玉米根须早期发育有关microRNA及靶基因之鉴别1前言1.1玉米根的形态及研究玉米属于一年生禾本科谷类植物，是世界上最主要的淀粉，并在生物能源生产中起着不可替代的重要功能（Hochholdinger等，2009）。成熟玉米植株根系复杂，是由不同生长阶段形成的不同形态的根所组成，并对玉米高大植株的正常生长提供强有力支撑（Feldman，1994；Hochholdinger等，2004a，b）。在玉米胚胎形成过程中在会从胚胎基底部生长出一条初生根（primaryroot），及盾片节点处着生出多条种子根（seminalroot）（图1A）。它们是玉米幼苗发育期中全部营养和水

2、分吸收的，对其苗期生长发育起着重要的作用（Hochholdinger等，2004a，b）。在玉米后期发育的过程中会形成茎生根（shootborneroot）和着生在所有形态根上的侧根（lateralroot），它们构成了玉米的胚后根系。茎生根的根原基形成于维管束周围的内皮层中，属于内原起始根，是茎内部（内皮层内侧的维管束鞘）的细胞恢复分裂能力，经过多次切线分裂，突破内皮层向外伸长形成的。茎生根包括地下部分第一胚芽鞘节上和地下茎节上茎生的冠根（croont等克隆获得了ZmTIP1，它编码的蛋白质与拟南芥γ-TIP基因的氨基酸序列具有76%的同源性，并通过Nor

3、thern杂交的方法证明ZmTIP1主要在主根根尖、侧根、叶原基和花序中表达，有可能参与到玉米根系发育的调控过程中（Chaumont等，1998）。Knauss等通过克隆拟南芥中根发育调节的同源基因的方法获得了一个调控玉米根系发育的关键基因ZmSAUR2基因，它能够在生长素的调解下引起胚芽鞘的伸长（Knauss等，2003）；Zimmerman等通过克隆双子叶植物番茄和拟南芥的类GAST（GibberellicAcidStimulatedTranscript-like）基因家族成员，发现了玉米基因组中10个新的类GAST基因并将其命名为ZmGSL（Z.maysGibbe

4、rellicAcidStimulated-Like），通过进一步的分析，发现GSL基因可能直接参与到GA调控的玉米侧根早期发育过程中（Zimmermann等，2010）。2材料与方法2.1实验材料玉米（ZeamayL）自交系H5468。2.1.2酶与各种生化试剂TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、Real-time试剂、DNAMarker，反转录酶，DNase，RNase抑制剂购于TAKARA公司；小分子RNA提取试剂盒、miRcutemiRNAcDNA第一链合成试剂盒、miRcutemiRNA荧光定量检测试剂盒购于TIANGEN公司；TRIZOL购自Invitr

5、ogen公司；苯酚、氯仿、无水乙醇等化学试剂为上海生工产品。基于Solexa高通量测序技术的小RNA数字化分析，采用边合成边测序（SBS-sequencingbysynthesis），可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，一次性获得数百万条小分子RNA序列，能够快速全面地鉴定该物种在该状态下的小分子RNA并发现新的小分子RNA，构建样品之间的小分子RNA差异表达谱，为小分子RNA功能研究提供有力工具。3结果与分析.......................40-613.1Solexa测序

6、的分析.....................40-433.1.1Solexa测序的表达丰度.....................40-423.1.2序列的基因定位.....................42-433.2保守miRNA的鉴定.....................43-463.3保守miRNA差异表达分析.....................46-483.4差异miRNA的RT验证.....................483.5保守miRNA靶基因的预测.....................48-503.6差异miRNA靶基因的RT

7、验证.....................50-543.7新miRNA的鉴定.....................54-583.8新miRNA差异表达分析及qRT-PCR验.....................58-614讨论.....................61-635结论.....................63-64结论为了获得玉米气生根发育及生长素调节相关miRNA，我们构建了三个小RNA文库并通过Solexa高通量测序技术进行了测序分析。经对测序结果的分析和实验验证得到如下结论：（1）三个库分别得到8,5