冠心活血胶囊有效提取部位研究

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1、冠心活血胶囊有效提取部位研宄樊越澜(内蒙古头市钢第三职工医院014010)【中图分类号】R29【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2013)07-0026-02【摘要】目的通过正交设计，观察冠心活血胶囊不同提取部位含药血清对过氧化氢(H2O2)诱导人脐静脉内皮细胞(ECV304)氧化损伤的影响。方法利用血清药理学方法制备冠心活血胶囊不同提取部位的含药血清，在体外H2O2干预建立ECV304细胞氧化损伤模型。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测冠心活血胶囊不同提取部位对H2O2诱导的ECV304细胞氧化损伤的影响。结果冠心活血胶囊

2、中挥发油和丹参等四味药材的醇提物只有抗氧化作用，丹参等四味药材的水提物和檀香等药材的水提物没有抗氧化作用。结论得出冠心活血胶囊原药中发挥抗氧化作用的活性部位，进而可以考虑优化制备工艺。【关键词】冠心活血胶囊血清药理学人脐静脉内皮细胞抗氧化冠心活血胶囊是蒙医临床使用多年的验方，由檀香、降香、紫檀香、肉豆蔻、丹参、广枣、沙棘、沉香、山奈、荜茇十味蒙药材组成。具有活血化瘀［1］，强心止痛的功效。临床用于治疗冠心病，心烦心悸，心绞痛。但因其成分复杂,服药剂量大，影响临床应用，故在原处方基础上进行工艺改进，运用正交设计方法和血清药理学方法探讨冠

3、心活血方剂不同提取成分含药血清对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞氧化损伤的影响。以期为进一步的工艺研究奠定基础。1.实验材料与试剂1.1动物及细胞株Wistar大鼠，雌雄各半(180±20)g，由内蒙古大学动物中心提供，人脐静脉内皮细胞(ECV340),购自中国典型培养物保藏中心。1.2药物及试剂试剂青霉素-链霉素双抗，胎牛血清，胰蛋白酶，甲基偶氮唑盐，DMSO液京，RPMIMedium1640,双氧水H2O2。1.3仪器C02培养箱，低温离心机，倒置显微镜，酶标仪，PHS-25型PH计，78-1磁力加热搅拌器，电热恒温干

4、燥箱1.实验方法及过程2.1样品药物的制备2.1.1考察因素及水平：根据冠心活血胶囊制备工艺，设计冠心活血胶囊的有效部位为挥发汕、丹参等醇提物、丹参等水提物、檀香等水提物。2.1.2药物的提取2.1.2.1制备丹参等醇提物2.1.2.2制备丹参等水提物2.1.3按L9（34）正交设计表配制药物，得9份样品药物。2.2含药血清的制备将样品药物给大鼠灌胃，1.5ml/l00g,每天2次，连续5天，腹主动脉采血，静置30min于4°C于3000r/min离心15min，分离血清，56°C火活30min,微孔滤膜过滤除菌。收集血清，备用。2.

5、3人脐静脉细胞（ECV340）培养ECV340常规方法培养：以含10%胎牛血清，1%的双抗的1640培养液培养ECV340细胞，置于37°C,5%CO2条件培养，定期换液，待细胞进入对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化传代。96孔板的接种：取生长良好的对数生长期细胞，用0.25%的胰酶消化，制成细胞悬液，以5*104/ml的密度接种于96孔板上（每孔100ul）,培养24小吋后,换为含5%胎牛血清1640培养液培养24h后细胞生长至50%-60%用于实验。2.4筛选过氧化氢氧化损伤的最适浓度以终浓度为100[2]、200、400、60

6、0umol/L过氧化氢干预接种于96孔板的ECV340细胞，每组8孔，干预12h后，吸弃培养液，加无血清培养液和H2O2,MTT法检测细胞活力，即每孔加5g/L的MTT液10μL，培养4h后吸弃75ul培养液，再加75ul二甲基亚砜（DMSO）并震荡。用酶标仪（波长为490nm及570nm）检测吸光度A值。得出H2O2浓度为200umol/L吋效果较好，另外结合有关H2O2对细胞损伤的相关文献［3,4］，所以本实验H2O2的浓度为200umo/L。2.5MTT法检测含药血清对细胞氧化损伤的影响2.5.1冠心活血胶囊原药的含药血清

7、的抗氧化活性的考察选取8只wistar大鼠，随机分为2组，即原药组、阳性对照组，制备含药血清（处理方法同2.2）。取细胞培养板，每孔加入经微孔滤膜火菌的1640培养液lOOul,每组设8复孔，分为以下几组：（1）含原药血清组，（2）阳性对照组（3）模型组，（4）阴型对照组。（1）（2）两组每孔加血清20ul,预处理8h,（1）〜（3）组加终浓度为200umol/L的H2O2和终浓度同前的含药血清（血清占总体积的1/5）继续培养12h后，然后加入10ul浓度为5g/L的MTT，培养4h，再加入75ul的DMSO,用酶标仪测定96孔板在5

8、70nm及490nm处的吸收值，记录数据，进行统计学处理。2.5.2冠心活血胶囊不同提取部位抗氧化活性的考察选取大鼠40只wistar大鼠，随机分成10组，分别为（1）〜（9）给药组（9种样品药），（10）阳性对照组。制