长春新碱致神经病理性疼痛模型中胶质细胞及il1β、gdnf表达的变化

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1、长春新碱致神经病理性疼痛模型中胶质细胞及IL1β、GDNF表达的变化【关键词】长春新碱；疼痛；胶质细胞；胶质细胞源性神经营养因子　　ActivationofGlialCellsandExpressionChangeofIL1β,GDNFinVincristineinducedNeuropathicPain　　Abstract：ObjectiveGlialcellsplayessentialrolesincreationandmaintenanceofpainstate.Thisstudyodelb

2、yusingrepeatedintraperitonedinjectionofvincristine.Byimmunohistochchemicaltechnique,theexpressionofspecificactivationmarkersofastrocytesandmicroglials,glialfibrillaryacidicprotein(GFAP)andOX42respectively,inedinbrainandlumbarintumescentia.UsingRTPCRana

3、lysistechniques,theexpressionofinterleukine1β(IL1β)andglialcelllinederivedneurotrophicfactor(GDNF)inlumbarintumescentiaalhyperalgsiaappearedonthe5thdayofvincristinetreatment.Glialcellsotherapygroup,icPlanter机械测痛仪，37300型热平板试验仪。大鼠以随机数字法分为2组，测基础体重、机械痛阈和热

4、痛耐受时间。以第1次注射长春新碱为第1天，给药组第1～5天和第8～12天腹腔注射0.1mg·(kg·d)-1长春新碱注射液（以生理盐水稀释至1ml），对照组注射1ml生理盐水。分别于第3、5、8、10、12天测大鼠体重、机械痛阈及热痛耐受时间，同时观察大鼠运动、饮食及脱毛等情况。测机械痛阈及热痛耐受时间时，先将大鼠置测试仪上10～15min待其安静，两次测定间隔5min，左右足各重复3次，取平均值。　　1．2免疫组织化学检测胶质细胞活化胶质纤维酸性蛋白(Glialfibrillaryacidicprot

5、ein,GFAP)多克隆抗体购自Neuromarker公司，1∶100稀释。小胶质细胞标志物OX42(CR3,CD11b)单克隆抗体购自Serotec公司，1∶50稀释。第12天取大鼠脑部及脊髓腰膨大处（留0.5cm提取RNA）。常规方法制成厚30μm冰冻切片，常规免疫组化SP法检测GFAP和OX42的表达。光镜下检测棕黄色DAB染色阳性细胞。结果判断：按Colburn等[2]所述活化分级方法评分。评分（·）：胶质细胞无活化，胶质细胞分支好。评分（+）：胶质细胞仍分支但活化标志物表达增加，细胞密度增

6、加。评分（++）：胶质细胞分支减少，活化标志物表达明显增加，细胞有时重叠。评分（+++）：胶质细胞分支粗短，活化标志物明显增加，细胞重叠明显。+～+++均为阳性。　　　　1．3RTPCR检测脊髓腰段中GDNFmRNA水平表达Trizol试剂盒购自华舜生物公司，逆转录试剂盒购自Fermentas公司，PCR试剂盒购自Promega公司。处死大鼠后迅速取腰膨大处约0.5cm脊髓加入匀浆器，参考RNA抽提说明书提取总RNA。取2μg总RNA，参考RT试剂盒说明合成cDNA。内参照βactin上游引物：5’

7、aagatttggcaccacactttctac3’，下游引物：5’acacttcatgatggaattgaatgt3’；IL1β上游引物：5’TGATGTTCCCATTAGACAGC3，下游引物：5’GAGGTGCTGATGTACCAGTT3’；GDNF上游引物：5’CAGCATATGTCACCAGATAAACAAGCGGCGGCACT3’，下游引物：5’CAGGGATCCGGGTCAGATACATCCACACCGTTTAGC3’，均由博亚生物公司合成。以1μlcDNA为模

8、板，常规PCR50μl体系反应。产物在溴乙锭处理的琼脂糖凝胶中电泳，将目的条带与内参照βactin条带的吸光度比值作为其相对表达量，重复3次。　　2．2机械痛阈和热痛耐受时间改变给药组与对照组后肢基础平均机械痛阈及后肢基础平均热痛耐受时间均无显著性差异。给药组与对照组至第8天机械痛阈差异开始具有显著性，至第12天两组之间差异最大，分别为(25.1±4.6)g和(38.3±2.0)g，P＝0.001，给药组较对照组痛阈降低35%,见图1A。