谷胱甘肽过氧化物酶在猪体内的分布和动态变化

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1、谷胱甘肽过氧化物酶在猪体内的分布和动态变化　　谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase,EC1.11.1.9,简称GPx)是生物机体组织中存在的3种重要的抗氧化酶之一,也是一种重要的含硒酶,硒是该酶活性中心的构成成分;它的生物学作用主要是清除脂质氢过氧化物,并在过氧化氢酶含量很少或H2O2产量很低的组织中,代替过氧化氢酶清除H2O2发挥抗氧化作用.目前研究表明GPx具有清除氢过氧化物、阻止癌症启动ROS对机体DNA的损伤,抑制癌细胞的扩散、转移和再生;保护线粒体ATP免受氧化应激的影响,

2、抑制线粒体凋亡的发生以及对神经退行性疾病具有一定的神经保护作用.因此说,GPx是一种有发展潜力的医药用酶和动物饲料添加剂.正常情况下,GPx的活力保持在一个相对稳定的状态,但在病理情况下,当体内活性氧发生堆积时,GPx必然会与其他的抗氧化酶协同参与调节过程,因此它的活力也会随着这种调节过程发生动态变化.GPx对于有些疾病,如鼠的中毒性肝炎,该酶的活力会伴随着疾病的发生而上升;而另一些疾病,如阿尔茨海默病,该酶的活力则会伴随着疾病的发生而下降;因此认为该酶可作为某些疾病的辅助诊断指标.此外,血浆和红细胞的GPx

3、活力也会随着年龄的增长而发生变化.也有研究发现,同一动物不同性别间GPx的活力也存在差异.本研究通过对不同猪种、不同性别、不同组织及猪生长发育的不同阶段、不同健康状况下GPx的活力进行研究.了解GPx在猪体内的分布和动态变化,为以该酶的活力水平来评定猪的健康状态,并作为某些猪病的辅助诊断治疗指标提供参考,同时确定富含GPx的组织和采集时期,为选择GPx含量最丰富的原材料,进一步开发应用该酶提供依据.　　1、材料与方法　　1.1试验动物　　26、30、90、150日龄蓝塘猪与长白猪(均为公猪),每品种每龄期各5

4、头,共40头猪,由东莞板岭猪场提供.90日龄杜大长(杜洛克、大白、长白)三元杂健康公、母猪各7头,共14头猪,由珠海市那洲猪场提供.90日龄杜大长(杜洛克、大白、长白)三元杂患副嗜血杆菌病1周的猪(应用PCR进行鉴定诊断),公、母各11头,共22头猪,由珠海市那洲猪场提供.　　1.2主要试剂　　谷胱甘肽(GSH),Amresco公司产品;5,5'-二硫代对二硝基苯甲酸(DTNB),Sigma公司产品;牛血清白蛋白,Fluka公司产品;考马斯亮蓝G250,USB公司产品;肝素,广州齐云生物公司产品;其他

5、试剂均为市售分析纯.　　1.3试验方法　　1.3.1样品制备血样采集:分别选取26(断奶前)、30、90、150日龄的长白和蓝塘公猪各5头(同一品种体质量间无差异,健康状态无差异)颈静脉取血2mL,加入事先用肝素处理过的离心管中,置于冰箱中冷藏待用,在1d内测定酶活力.测定前取10μL全血加到1mL双蒸水中,充分振摇,使之全部溶血成为1∶100溶血液即为待测样品.取90日龄杜大长三元杂健康及患病公、母猪各11头,颈静脉采血.血样处理方法与前述相同.组织样品采集:分别取150日龄的长白猪和蓝塘猪公猪各5头

6、(同一品种间体质量无差异,健康状态无差异),屠宰后,立即采集肾、脾、肺、肝、心、胰、胃、脑、肌肉以及肠(其中肠分为空肠、结肠、回肠、十二指肠、盲肠)等组织采集鲜物样品约5g,用20mmol/LpH7.2的磷酸缓冲液冲洗3次后,包装好,置于-70℃的冰箱中冷藏备用,在3d内测定样品的酶活力.测定前取出样品,将组织样品用4℃、质量分数为0.86%的生理盐水漂洗,除去血液,滤纸拭干,准确称取0.4g,放入10mL的小烧杯内.用量筒量预冷的匀浆介质(pH7.2,20mmol/L,内含1mmol/LEDTANa2的磷酸

7、缓冲液),匀浆介质是组织质量的9倍.用移液枪将总量2/3的匀浆介质移入烧杯中,用眼科小剪尽快剪碎组织块(在冰浴条件下进行),然后将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再用剩余的1/3匀浆介质冲洗残余在小烧杯中的碎组织一起倒入玻璃匀浆管中进行匀浆,上下转动研磨数十次,充分磨碎,得到质量分数为10%的组织匀浆液,以4000r/min离心10min,取上清液0.5mL加入1.5mL匀浆介质混匀以后测定酶活力.　　1.3.2猪副嗜血杆菌病的诊断参照吴诗敏的方法通过PCR进行鉴定诊断.　　1.3.3GPx活力的测定参照荣征星等

8、和蒙秋锁等的测定方法,并作适当改进.　　1.3.4蛋白质质量浓度的测定按Bradford的方法,并以牛血清白蛋白为标准蛋白质.　　1.3.5数据处理和统计分析采用SPSS17.0进行数据分析.所有数据采用平均值±标准误表示.2种数据间的比较采用T-tests,多组数据比较采用Dun-cans新复极差法.　　2、结果与分析　　2.1猪不同日龄GPx活力的动态变化　　分别对26~150日龄