骨髓培养和染色体标本制备操作流程

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1、骨髓培养及染色体标本制备操作流程细胞培养：1．准备1个培养瓶，加入10.0mlIrvineScientific公司的陈氏培养基BMC2.样品加入前，37预温。3．加入0.5ml(500µl)的骨髓样品。如果外周血中白细胞>30000ⅹ109个/毫升，加入少量的样品。如果外周血中白细胞<5000ⅹ109个/毫升，加入较多的样品。4．摇匀，放入二氧化培养箱孵育1-2天。收获试管：1.用无菌移液管（不要倒）把培养瓶中的培养液转移至15ml的离心管中2.然后每个离心管中加入80µl（0.08ml）脱碳秋水仙碱（10µg/m

2、l）。盖上盖，轻轻的多次颠倒直到样品混合均匀。3.放入37.0℃孵育箱20分钟。4.转速1200，离心8分钟。吸去上清液5.用手指拨动试管底部以混匀沉积细胞。把试管放在涡旋器上，速度设定在慢档，很慢的加入10ml0.075MKCL低渗液。6.室温静置20分钟（低渗处理），离心8分钟7.去除上清液，留下大约1ml的低渗液和沉积细胞。注意有时纤维性的物质经过离心与细胞一起混合沉积，部分浮在上清液里，用离心机抽吸最后几毫升的上清液时，容易把纤维性的物质和细胞一起抽吸掉。为防止这种情况发生，可用巴士德吸管人工吸掉上清液。8

3、.用手指拨动试管底部以混匀沉积细胞。把试管放在涡旋器上，速度设定在慢档，很慢地加入10ml3：1甲醇：乙酸的固定液。9.室温静置15分钟（第一次）10.转速1200，离心8分钟。11.去上清液，混合沉积细胞，象前一次一样加入固定液5ml。（第二次）12.转速1200，离心8分钟。13.去上清液，混合沉积细胞，象前一次一样加入固定液5ml。（第三次）14.转速1200，离心8分钟。制片：1.离心5ml的细胞悬液，去上清液2.在少量固定液中混匀细胞。具体的量决定于细胞的多少。制片前，把预处理的玻片用超净水冲洗后，并浸没

4、。3.用干净的镊子，把玻片从水中取出，用吸水纸吸取多余的水份，留下薄薄一层水膜。擦去玻片反面的水珠，立即开始滴片。4.用巴士德吸管混匀细胞悬液。吸取少量的细胞悬液（够滴一张片子）。不要把细胞悬液吸上太多，以防细胞黏附在吸管，导致细胞丢失。5.用以下的两种方法滴片a.以30o角度竖起玻片，吸管距离玻片0-3cm，滴1-2滴的细胞悬液在近毛玻片处，让细胞悬液向下流，用吸水纸吸去多余的水。b.平放玻片，吸管距离玻片0-3cm，，滴1滴的细胞悬液在玻片中央处，用吸水纸在边缘吸去多余的水。用这种方法时，不要滴两滴在玻片上，导

5、致细胞不均匀的干燥。6.让细胞悬液均匀的分布到玻片上。干燥时应在1-2分钟。7.将片子置于45-60oC的烤箱中过夜，染色前还需要在90oC的烤箱中烤15-30分钟。染色：（1）放置6个染色缸#1(100ml)98ml生理盐水缓冲液2ml胰岛素储存液[12.8mg/ml]*****用0.2MNa2HPO4调节pH致7.0#2(100ml)100ml生理盐水缓冲液(pH7.0)#3(100ml)100ml生理盐水缓冲液(pH7.0)#4(50ml)24ml麦氏染色缓冲液16ml蒸馏水14ml磊氏染色储存液[1.6mg

6、/ml]#5(100ml)100ml蒸馏水#6(100ml)100ml蒸馏水（2）染色时，把玻片完全浸入染色缸中缸#1胰岛素储存液10-20秒缸#2冲洗液完全浸洗缸#3冲洗液完全浸洗缸#4染色21/2-3分钟缸#5冲洗液完全浸洗缸#6冲洗液完全浸洗（3）磊氏染色储存液会形成一种发亮的浮在表面的物质，染色前要先用吸水纸吸去。（4）用吸水纸吸干或空气吹干片子。