实验4 肠道致病菌分离鉴定

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1、微生物学实验四肠道致病菌分离鉴定微生物学教研室郭棵棵（综合性实验）录像：球菌操作：1、化脓性球菌分离鉴定（二）（1）革兰染色（2）转种甘露醇或血清肉汤（3）血浆凝固酶实验（4）触酶实验2、肠道菌分离鉴定（一）——粪便标本接种S.S平板材料：（1）载玻片1-2张/人（2）甘露醇或血清肉汤1支/人（3）新鲜兔血浆、生理盐水各1支/6人（4）S.S平板1块/人（5）粪便标本：伤寒、痢疾、副甲、副乙1套/教室实验内容了解：肠道致病菌的血清学鉴定触酶实验、血浆凝固酶实验的原理掌握：1.肠道致病菌分离鉴定的方法、步骤及生化反应2.化脓性球菌转种甘露醇或血清肉汤的目的3.触酶、血浆凝固酶实验的结果

2、观察[教学目标]观察上次实验结果、进行分析紫外线杀菌实验抗生素敏感试验抑菌圈直径如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈形成，敏感度越高抑菌圈直径越大：>20mm：极度敏感5-20mm：中度敏感10-15mm：轻度敏感<10mm:不敏感无抑菌圈:耐药化脓性球菌分离鉴定（二）脓汁血平板菌落葡萄状排列链状排列血浆凝固酶实验甘露醇发酵实验血清肉汤管接种三线法37℃24h革兰染色触酶实验排列不典型2、操作革兰染色及镜检触酶实验血浆凝固酶实验转种甘露醇或血清肉汤涂片：先在玻片上放一滴生理盐水，然后刮取菌落在盐水中乳化，涂成直径约为1.0cm的膜。干燥：最好在室温中自然干燥，也可在远离火焰上方微

3、微烘干。但切勿靠火焰以免烤焦标本。固定：火焰固定。革兰染色过程：初染：结晶紫1分钟媒染：碘液1分钟脱色：95%酒精半分钟复染：稀释复红半分钟镜检：球阳杆阴阳紫阴红（1）革兰染色葡萄球菌链球菌H2O2catalase2H2O+O2（2）触酶实验原理：产生过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和分子氧出现气泡。操作步骤：在洁净玻片上滴一滴生理盐水，用接种环取少许细菌培养物与生理盐水中乳磨均匀，然后加3％过氧化氢数滴；或直接滴加3％过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。结果观察：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。G+球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为

4、阴性，故此试验常用于G+球菌的初步分群（3）血浆凝固酶试验1）原理致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，在血浆中激活剂的作用下，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白，导致血浆凝固；而非致病性葡萄球菌由于不产生此酶，故不能凝固血浆，二者可据此予以区别。2）操作：玻片法取干净玻片一块血浆及生理盐水各一滴，分别置于玻片两端用接种环取细菌少许，分别与生理盐水及血浆充分混匀结果观察：30秒钟内盐水中的细菌呈均匀浑浊，而兔血浆则呈块状或颗粒状者为阳性。（4）甘露醇试验或血清肉汤接种1）甘露醇发酵试验：接种甘露醇单糖管，观察颜色改变及气体产生情况。发酵甘露醇产酸者，使酸碱指示剂（溴麝香草酚兰）在

5、酸性环境下由蓝色转变为黄色。2）接种血清肉汤：观察细菌生长状态沉淀生长？混浊生长？部分沉淀，上清液混浊生长？肠道菌分离鉴定（一）肠道杆菌是一大群寄居在人类和动物的肠道中的生物学性状近似的革兰阴性的杆菌，该类细菌无芽胞，多数有周鞭毛。需氧或兼性厌氧，能分解葡萄糖及其他碳水化合物，产酸、有些产气。多数肠道菌是肠道的正常菌群，当宿主免疫力降低或侵入肠道外等部位时，也可成为条件致病菌引起疾病。有的肠道杆菌例如伤寒沙门菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌等，是肠道致病菌，可导致人类某些肠道传染病。肠道菌的种类繁多，为成功地检出病原菌，通常选用选择或鉴别培养基。除提供细菌生长所需营养物外，还含有抑菌剂和

6、指示剂。可有选择性抑制某些肠道细菌的生长，指示剂则能鉴别细菌的生化特性。本次试验以粪便为标本进行肠道菌的分离鉴定。粪便标本中含有伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌以及大肠杆菌等肠道菌，要求从标本中分离出单一的致病菌，并通过后续的试验鉴定出致病菌。S.S琼脂培养基中含有胆盐、煌绿和枸橼酸钠等成分，不仅能抑制G+菌的生长，也能抑制肠道非致病菌的生长。S.S琼脂培养基大肠杆菌在此平板上生长，可分解培养基中乳糖产酸，与胆盐作用形成胆酸沉淀，使中性红指示剂变红，形成红色浑浊不透明菌落。肠道致病菌则不分解乳糖，形成无色或淡黄色菌落（因分解蛋白质产生碱性物质）。SS琼脂培养基（Salmonella-S

7、higellaagar）大肠埃希菌沙门菌志贺菌操作：粪便S.S.平板挑选可疑菌落培养24h37℃接种三线法肠道菌分离鉴定（一）1、用无菌接种环挑取少量粪便标本，用划线法接种于S.S平板上进行分离培养。2、放置于37ºC孵箱内培养18-24小时，观察平板上所生长的菌落，依据其形态大小，透明度和颜色等特点，初步识别致病菌和非致病菌。操作：化脓性感染采取哪些标本送检有辅助诊断意义？为什么要用血浆凝固酶试验鉴别致病性与非致病性葡萄球菌？思考题thanks