烟碱降解菌scuec2菌株的分离及其降解特性

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1、烟碱降解菌SCUEC2菌株的分离及其降解特性李阳１，杨振飞１，马婷婷１，陈涛２，龚传清２，李永辉２，李晓华１（１．中南民族大学生命科学学院／生物技术国家民委重点实验室，武汉４３００７４；２．湖北省烟草公司襄阳市公司，湖北襄阳４４１００３）摘要：以烟碱为惟一碳源，从湖北省襄阳市烟草种植土壤中分离得到１株烟碱降解菌，为蒙氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）ＳＣＵＥＣ２。在３０℃下，１８０ｒ／ｍｉｎ摇床培养，烟碱质量浓度为１．００ｇ／Ｌ时，发酵１０ｈ后烟碱降解率达到８８．８０％。在３０℃下，

2、１８０ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ｈ，烟碱质量浓度为６．００ｇ／Ｌ时，烟碱降解率为８２．５９％；烟碱质量浓度为７．００ｇ／Ｌ时，烟碱降解率和菌株生长呈下降趋势，烟碱降解率为１８．９４％。ＳＣＵＥＣ２菌株发酵液经ＨＰＬＣ检测，结果显示，烟碱的保留时间为５．２５ｍｉｎ左右，在培养到１６ｈ时，烟碱峰峰面积明显减小，并在保留时间为１１．７９ｍｉｎ左右处出现一个新色谱峰，表明有中间代谢产物产生。..关键词：烟碱；生物降解；蒙氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）；降解特性中图分类号：Ｑ９３９．１１＋２；

3、Ｓ５７２；Ｓ１５４．３文献标识码：A：0439－８114（２０15）07－1586-04DOI:10.14088/j.ki.issn0439-8114.2015.07.013烟碱俗称尼古丁（ｎｉｃｏｔｉｎｅ），是烟草中的主要生物碱。烟碱对人体有害，很容易被人体吸收，是吸烟上瘾的主要物质，会引起人体的心血管疾病［１］。烟碱易溶于水，在烟草种植和香烟生产上很容易造成固体和液体的高浓度污染，严重污染环境和威胁人类健康。欧盟已将每千克烟碱含量超过５００ｍｇ的烟草废弃物规定为“有毒有害物”，其他一些国家也规定了各

4、自相应的标准［２，３］。因此，烟碱降解成为迫切需要解决的问题，而利用微生物降解烟碱是一种低成本、高效率且对环境影响小的方法［４］。近年来，微生物降解烟碱的研究受到关注，降解烟碱的微生物主要有嗜烟碱节杆菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ）［５－８］、假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）［３，９－１３］、中间苍白杆菌（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）［１，１４］、土壤杆菌属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）［１５－１７］、红球菌属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）

5、［１８］、米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）［１９］等。本研究从湖北省襄阳市烟草种植地土壤分离出１株新菌株蒙氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｏｎｔｅｉｌｉｉ），具有较高的降解烟碱性能，通过对其降解性能进行研究，旨在为降低烟叶和烟厂废弃物中烟碱含量提供依据。１材料与方法１．１材料１．1．１样品土壤样品采自湖北省襄阳市烟草种植地土壤。１．1．２培养基烟碱培养基：１３．３０ｇＫ２ＨＰＯ４，４．００ｇＫＨ２ＰＯ４，０．１０ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１．００ｇ酵母粉，１０．００ｍＬ微量元素（１．００ｇＭ

6、ｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．４０ｇＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ，０．２０ｇＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，０．２０ｇＣｕＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，０．０２ｇＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，用０．１０ｍｏｌ／ＬＨＣｌ溶液溶解定容至０．１０Ｌ），用去离子水定容至１．００Ｌ，自然ｐＨ。高压蒸汽灭菌后，加入一定量烟碱（用０．２２μｍ滤膜过滤）。烟碱分离培养基：烟碱培养基中加入１．８％的琼脂。种子培养基：１０．００ｇ胰蛋白胨，５．００ｇ酵母浸粉，１０．００ｇＮａＣｌ，先溶于０．９０Ｌ去离子水，用５．００ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液调ｐＨ至７．００，再用去离子

7、水定容至１．００Ｌ。培养基１２１℃高压蒸汽灭菌２０ｍｉｎ。１．１．３主要试剂和仪器烟碱（纯度≥９８％）购自洛阳天科生物工程有限公司；ＵＶ－６１００ＰＣ紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００高效液相色谱仪（美国戴安公司）；ＨＺ－９２１１Ｋ空气恒温振荡器（太仓市华利达实验设备有限公司）；ＣＲ２２Ｇ高速冷冻离心机（日本日立公司）。１．２烟碱降解菌的分离称取２．００ｇ土壤样品于２０．００ｍＬ烟碱培养基，３０℃、１８０ｒ／ｍｉｎ摇床培养。用０．９０％生理盐水梯度稀释，涂布于烟碱分离

8、培养基，于３０℃培养，挑取菌株划线分离纯化。分别将纯化的菌株接入烟碱培养基中，于３０℃、１８０ｒ／ｍｉｎ摇床培养，测定发酵液中烟碱质量浓度。１．３烟碱培养基中烟碱质量浓度的测定将菌株接入烟碱培养基中，于３０℃、１８０ｒ／ｍｉｎ摇床培养，用不接菌的烟碱培养基作空白对照（ＣＫ）。发酵液在１２０００ｒ／ｍｉｎ条件下离心５ｍｉｎ，上清液用０．０５ｍｏｌ／ＬＨＣｌ溶液稀释到合适的吸光值范围。以０．０５ｍｏｌ／ＬＨＣｌ溶液作参比，测定发酵液在紫外光波长