人血管内皮抑制素vasostatin120

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1、人血管内皮抑制素vasostatin120【摘要】目的:在大肠杆菌中克隆和表达人源血管内皮抑制素vasostatin120-180（VAS）基因，并进行分离纯化及抑制新生血管生成活性鉴定。方法：根据大肠杆菌偏爱密码子,应用化学合成和分子克隆方法得到人源血管内皮抑制素120-180片段（即VAS）的编码基因。通过PCR和限制性内切酶消解，将VAS编码基因克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中，并在BL21（DE3）菌株中经IPTG诱导、表达带有His融合标签的His-VAS重组蛋白。VAS蛋白的表达水平大约占细菌总蛋白的45%，大

2、多数目的蛋白以包涵体形式存在,经过体外包涵体变性、复性及纯化，采用SDS-PAGE分析鉴定，用鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验进行重组蛋白活性的生物活性鉴定。结果：经DNA序列分析鉴定，重组质粒pET28a-VAS构建成功，IPTG诱导后的融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，statin［7］等已经被鉴定出来，实验证明这些分子能靶向血管内皮细胞，进而阻止肿瘤生长。其中Vasostatin为钙网蛋白calreticulinN端1-180氨基酸的结构域，是一种血管生成抑制剂，在体内具有抗肿瘤效果。它能特异地抑制血管内皮细胞增殖，抑制新生血

3、管生成，能够阻止或减慢实验性肿瘤的生长［6］。进一步研究发现，钙网蛋白抗肿瘤活性存在于120-180氨基酸的结构域中［8］，本文称之为VAS。本研究设计并合成VAS的编码基因，在大肠杆菌中实现它的高效表达，进行分离纯化，并对其抑制血管生成活性初步鉴定，旨在为今后对VAS蛋白功能的进一步研究和药物开发打下基础［9］。1材料及方法1.1材料pET28a(+)质粒,大肠杆菌Top10（本试验室保存），PCR试剂，限制性内切酶（Promega），KlenoericanBiotechnologypany），3S柱离心式琼脂糖DNA小量快

4、速纯化试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)，寡核苷酸合成以及DNA测序服务（上海申能博彩生物科技有限公司），羊抗人calreticulin多抗(SantaCruzpany)，Ni-IDA、DEAE-sepharose填料(本实验室提供)。1.2方法1.2.1VAS基因的克隆及其表达载体的构建参照大肠杆菌偏爱的密码子［10］化学合成了10条寡核苷酸，寡核苷酸的长度为28～35个碱基，相邻的寡核苷酸有5～8个碱基相互配对，寡核苷酸的序列从5′到3′依次是：(1)CCGCTCGAGCATATGACTGACATGCACGGTGAC;

5、(2)GACCAAACATGATGTTGTATTCAGAGTCAC;(3)TTTGGTCCGGACATCTGCGGCCCGGGC;(4)GAAGATTACGTGAACTTTTTTGGTGCCCGG;(5)AATCTTCAACTACAAAGGCAAGAACGTTCTGATC;(6)GCAACGGATGTCCTTGTTTAGCAG;(7)GTTGCAAGGATGATGAATTTACACAC;(8)ACGAACAATCAGTGTGTACAGGTGTGT;(9)GTTCGTCCAGACAACTAATTGAATTCC;(10)GGAAT

6、TCAATTAGTTGTCTG。它们之间的重叠模式见图1。首先将所有的寡核苷酸稀释至100pmol·μl-1，而后按照以下步骤依次处理：T4多聚核苷酸激酶磷酸化,30℃退火,KlenoHⅠ的酶切位点(黑体)以及编码肠激酶识别位点DDDDK的序列（下划线部分），反向引物中有一个XhoⅠ的酶切位点(黑体)。PCR反应的条件为94℃热变性1min,55℃退火1min，72℃延伸30s，共进行25个循环，流程简图见图2。纯化的PCR产物采用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切,然后插入pET28a的多克隆位点。pET28a是一个T7系列的N

7、端融合His-tag的原核表达载体。对重组表达载体pET28-VAS进行DNA测序，分析其阅读框和编码序列的正确性。1.2.2融合蛋白His-VAS在大肠杆菌BL21中的诱导表达将His-VAS融合蛋白表达载体pET28a-VAS转入感受态表达宿主菌E.coliBL21(DE3)，挑取单克隆接种至新鲜的LB液体培养基(含50mg·L-1的卡那霉素)。在37℃待细菌长至OD600为1.0左右，加入终浓度为0.6mmol·L-1的IPTG诱导His-VAS的表达,诱导5h后收集菌体,处理后的菌体蛋白样品进行16.5%SDS-PAG

8、E分析。1.2.3包涵体的精制取上述1L发酵液离心收集菌体，每克菌体于10mlbufferA（20mmol·L-1Tris-HCl，50mmol·L-1NaCl，1mmol·L-1EDTA，1mol·L-1urea，0.5%Triton-100，pH8.0）重悬。在冰浴条件下