食品安全及检测.杨青

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1、金黄色葡萄球菌活的非可培养状态复苏及PMA-qPCR检测摘要：为研究金黄色葡萄球菌活的非可培养（VBNC）状态的复苏问题，采取温度、盐度和酸度3个因素复合诱导制备VBNC菌，尝试四种复苏方法，并以荧光定量PCR和PMA-qPCR技术结合的方法进行检测。结果证明:8%无菌Tween80可以使VBNC状态金黄色葡萄球菌48h后复苏，同时PMA-qPCR能够有效检出VBNC状态金黄色葡萄球菌，克服传统平板计数法对于VBNC菌的漏检。关键词：金黄色葡萄球菌；活的非可培养状态；复苏；PMA；荧光定量PCRResuscitationofviablebutnon-culturablestate

2、StaphylococcusaureusandPMA-qPCRdetectionAbstract:InordertostudytheResuscitationofviablebutnon-culturablestateStaphylococcusaureus,threefactors:temperature,saltconcentrationsandpHwerecompositetoinduceVBNC20Staphylococcusaureus.Fourdifferentresuscitationswereattempted,qPCRandPMAincombinationwit

3、hqPCRwasestablishedtodetectStaphyloccocusaureus.ThedateshowsthattheVBNCsamplescouldresuscitatein48hafterdisposed8%Tween80.Atthesametime,PMA-qPCRwasaeffectivemethodfordetectionofVBNCStaphyloccocusaureus,andcouldovercometheshortcomingsofplatecounts.Keywords:Staphyloccocusaureus;viablebutnoncult

4、urablestate;resuscitation;PMA;qPCR引言微生物在自然环境中以多种生理状态存在：可培养的活菌，活的非可培养状态，具有完整结构但无生物活性的死菌以及细胞膜损伤死菌。徐怀恕等[1]通过对霍乱弧菌和大肠杆菌存30活规律的研究，发现细菌存在一种“活的非可培养状态”(viablebutnonculturablestate,VBNC)。当细菌处于不良环境条件下时,用常规方法培养不能生长繁殖,但仍然具有一定的活性。处于VBNC状态的细菌,仍具有毒性，在适宜的条件下有可能复苏[2]。不同菌种甚至同一菌种的不同菌株之间进入VBNC的特征和复苏存在差异。自然环境中的各种

5、因素,如温度、渗透压、营养成分、氧气指数甚至光照强度若发生改变都可以诱导35细菌进入VBNC状态，通常这些变化均是向着不利于正常细胞存活的方向的[3]。在实验室条件下，可以通过控制金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的培养条件诱导其进入VBNC状态。曹小红等[4]将金黄色葡萄球菌分别在低温和重金属条件下成功诱导使其进入VBNC状态，并且利用过氧化氢酶和吐温20使VBNC状态金黄色葡萄球菌在短时间内实现复苏。目前对于金黄色葡萄球菌的VBNC状态研究较少，并且缺乏快速有效的检测方法。国内对金黄色葡萄球菌的检测主要参照国家标准检测方法进行。虽然对样本中有无活菌的存

6、在提供确切而直接的证据,但检出时间较长,步骤较为繁琐,不适用于快速检测。而且，标准难以检出处于VBNC状态的细菌。而荧光染料作为前处理手段，结合qPCR（fluorescencequantitative,荧光定量PCR）技术用于活菌检测已经取得大量的研究进展，并且具有广阔的潜在应用空间。PMA（propidiummonoazide，叠氮溴化丙锭）是一种选择性核酸交联染料，可以透过死细胞而不能透过活细胞的细胞膜，进入细胞后，PMA与DNA共价结合，从而阻碍了死细胞中目标DNA的扩增，结合荧光定量PCR技术检测活菌数，可以有效检测出样本中的活菌含量。VBNC菌是一种细胞膜没有损伤的活

7、菌，理论上用PMA-qPCR方法检测可行[5]。尝试在实验室环境下利用低温、低盐、低pH等不良生长条件,体外诱导金黄色葡萄球菌进入VBNC状态的基础上,对VBNC状态的金黄色葡萄球菌进行复苏实验，同时验证PMA-qPCR法对VBNC状态的金黄色葡萄球菌检测的适用性和可行性，从而构建一种准确、快速检测食源性致病性活菌的方法。1材料与方法1.1实验菌株及培养条件金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC6538)，菌株为实验室保存。金黄色葡萄球菌采用营养肉汤液体