实验六__微生物生理生化反应观察

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1、实验六微生物生理生化反应观察一、实验目的初步了解微生物生化鉴定与分类的原理与方法；掌握淀粉水解实验、明胶水解实验、尿素水解实验、糖发酵实验的原理和方法。二、实验原理1.淀粉酶能水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能产淀粉酶的微生物在淀粉培养基上培养用碘处理会产生无色区域，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。2.明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状态，以固体形式存在，而在25℃以上明胶会液化。如果接种的微生物能够产生明胶酶就可以使明胶生化管在25℃以下发生液化

2、，据此性质可以鉴别产明胶酶的微生物。3.尿素酶能够使尿素分解释放出氨气和二氧化碳，氨溶于水使加有酚红酸碱指示剂的营养琼脂由中性变成碱性，从而产生颜色变化（由黄色变成深粉红色）。通过生化管的颜色变化就可以判断接种的培养基是否产生尿素酶。4、有些微生物能够分解葡萄糖或乳糖产生有机酸（乳酸、醋酸、丙酸）使生化管的PH值降低，从而使含酸碱指示剂溴甲酚紫的营养琼脂由紫色变成黄色，通过生化管的颜色变化可以判断是否能产生相应的糖水解酶类。三、实验步骤（二人一组）1.淀粉水解实验：每人接种二支淀粉生化管（分别接种大肠杆菌

3、和枯草芽孢杆菌），37℃培养2d，加卢革氏碘液观察和记录每管颜色变化，得出结论。2.明胶水解实验：每人接种二支明胶生化管（分别接种大肠杆菌和金黄色葡萄球菌），20℃培养2天，从20℃取出即观察和记录各管的明胶水解情况，得出结论。3.尿素水解实验：每人接种两支尿素生化管（分别接种变形杆菌和金黄色葡萄球菌），37℃培养2天，观察和记录每管培养前后颜色变化，得出结论。4、葡萄糖发酵试验：每人接种二支葡萄糖生化管（一支接种大肠杆菌、一支接种变形杆菌），37℃培养2天，观察和记录每管培养前后颜色变化，得出结论。5、

4、乳糖发酵试验：每人接种二支乳糖生化管（一支接种大肠杆菌、一支接种变形杆菌），37℃培养2天，观察和记录每管培养前后颜色变化，得出结论。四、实验注意事项淀粉水解实验，在观察时需要加卢革氏碘液以便观察淀粉的水解情况；接种均在无菌条件下操作，接种完毕以后用灭菌好的棉花塞住管口防止污染；生化管用砂轮切割玻璃后接种。思考题接种后的明胶试管可以在37℃下培养，在培养后你必须做什么才能证明水解的存在?对你的实验现象进行分析示教肠道致病菌的分离鉴定分离鉴定步骤1、分离培养粪便标本划线分离S-S平板培养大，红色，非致病性菌

5、菌落小，无色半透明，为可疑菌落粪便标本划线分离粪便标本划线分离S-S平板粪便标本划线分离培养S-S平板粪便标本划线分离培养S-S平板粪便标本划线分离培养S-S平板粪便标本划线分离大，红色，非致病性菌菌落培养S-S平板粪便标本划线分离小，无色半透明，为可疑菌落大，红色，非致病性菌菌落培养S-S平板粪便标本划线分离2、初步鉴定选取可疑菌落转种半固体，双糖铁培养基培养观察培养基变化3、进一步鉴定对初步鉴定的菌种进一步做生化鉴定4、血清学鉴定肠道杆菌型别较多，常需血清学方法进行确证5、药敏试验为针对性治疗提供依据

6、（一）肠道杆菌的形态、染色及在选择培养基上的生长情况1、常见肠道致病菌菌种：伤寒杆菌、痢疾杆菌等2、选择培养基：SS平板、EMBSS琼脂培养基选择培养原理：此培养基是强选择性培养基中性红为指示剂，酸性时呈现红色，碱性时呈淡黄色。在此培养基上，大肠杆菌属的菌落大而混浊，因发酵乳糖，菌落呈现红色．志贺氏菌属和沙门氏菌属的菌落形态为光滑无色透明，园形、中等大小，边缘整齐的菌落。由于宋内氏痢疾杆菌有分解胆盐中的某些物质和发酵乳糖(产酸)较慢等特点，而使菌落呈淡红或红色的较大或边缘不整齐的扁平菌落。某些沙门氏菌属

7、及变形杆菌因产生硫化氢，使菌落呈现黑色中心。伊红美兰琼脂培养基（ＥＭＢ）选择培养原理：此培养基为弱选择性培养基。以伊红美兰作指示剂．（１）大肠杆菌分解乳糖产酸时染上伊红，因为伊红和美兰结合所以菌落不是红色而呈现紫黑色，且有金属光泽(大肠杆菌)或棕色(产气杆菌)，扁平混浊，而较大边缘色淡的菌落。（２）致病菌的菌落为无色半透明、园形，中等大小，边缘整齐的菌落，在靠近大肠杆菌的可疑菌落往往呈现淡兰色。方法：1、分离培养、观察菌落特征：分别取四的培养物，用分离划线方法接种SS平板或EMB培养基37℃培养18-24

8、h以后观察结果。2、革兰染色、观察形态学特征：取各菌培养物少许涂片，革兰染色、镜检。菌落观察SS平板沙门氏菌：无色透明菌落，有黑色中心志贺氏菌：无色透明菌落。肠道杆菌形态学观察（二）肠道杆菌生化反应及动力试验培养基：克氏双糖斜面培养基、生化反应管、半固体培养基克氏双糖斜面培养基生化反应原理该培养基含葡萄糖与乳糖的比例为1:10，并含硫酸亚铁和指示剂酚红。大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，所以上层呈黄色，直立段有气泡存在．肠道