地衣共生菌藻分离、

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1、第三章地衣共生菌藻的分离、培养和人工重建地衣是否能分为单个生物•不同有机组织的相互关系•更多的了解地衣的生理、形态、发育和分子生物学方面的问题•次生代谢物的研究一、共生真菌的分离和培养1、地衣型真菌常用的培养基2、子囊孢子释放法3、组织培养法4、培养共生菌的保存1、地衣型真菌常用的培养基•WA4培养基——含4%蒸馏水的琼脂培养基琼脂4g蒸馏水补足100ml•MY培养基——麦芽酵母提取物培养基麦芽提取物20g/酵母提取物2g/琼脂20g/蒸馏水补足1000ml•LB培养基——LillyandBar

2、nett’s培养基葡萄糖10g/天冬酰胺酸2g/KH2PO41g/MgSO4•7H2O0.5g/Fe(NO3)3•9H2O0.2mg/ZnSO4•7H2O0.2mg/MnSO4•4H2O0.1mg/维生素B10.1mg/维生素H5ug/蒸馏水补足100ml可以在以上组分上加入15~20g的琼脂，并补足1000ml，并制成固体培养基。•LBG培养基——Lillyandbarnettgelrite培养基LB培养基中以1%的Gelrite代替琼脂。注意：在利用和倒入皮氏培养皿（5mm）或试管（5ml）

3、之前应将所有培养基进行灭菌。4、培养共生菌的保存•共生菌可以存放很长时间（大约一年左右）。•通常共生菌在15~20℃时表现出最大生长率。每种均有其最适生长PH值，通常PH范围为5~6。太高或太低的PH均会阻碍其生长。•在共生菌群体保存培养中，光并不是必须的。•地衣共生菌可以在液氮中保存很长时间，仍能保持活性。二、共生藻及蓝细菌的分离和培养1、培养基2、培养前处理3、共生藻的培养4、无菌培养群体的分离5、共生藻培养的保存1、培养基•BBM培养基——Bold’sBasalMedium•3×NBBM培

4、养基•Trebouxia培养基•MDM培养基2、培养前处理1）清洗•对于大型地衣（叶状和枝状）：从地衣体顶端切下约1㎝2，然后放在自来水中浸泡5~10分钟，用画笔刷在流动的自来水中清理地衣体表面，然后用无菌水冲洗。•对于小型地衣：如果地衣体较小（多壳状地衣），可将其放入装有1~2ml的无菌水和一滴Tween－20的小试管中。超声波粉碎约3分钟。离心去除地衣体表面的附属物。2）地衣体匀浆液的制备•大型地衣（枝状或叶状）：（1）清洗之后，将地衣体放在一个无菌的载玻片上。（2）在解剖镜下，利用针锉平的

5、小刀仔细刮去地衣皮层。（3）在显微镜下，取下藻层并转移到一个新的无菌的玻片上。（4）在无菌玻片上滴一滴无菌水，用另一个玻片把切取的的共生藻层盖上，轻轻压玻片，将地衣体磨成较小碎片。这样，尽管仍有一些菌丝存在，但实际上共生藻就机械地同共生菌分离了。两种共生体均悬浮在液体中。•较小地衣体：清洗之后，将小部分地衣体放在无菌的载玻片之间，轻轻磨动玻片。不像大型地衣的处理，由于小型地衣没有去除表皮，故应需较大的压力。这样会得到含有菌藻的悬浊液。也可以采用搅拌器或研钵弄碎较大片地衣。但是，搅拌器会使脆弱的细

6、胞受到破坏，因此，应采用较温和的方法处理，如在两玻片间轻轻磨动。3、共生藻的培养•含共生藻的悬浊液•15天培养：15～20℃•共生藻群（1个月左右）•要注意藻的污染4、无菌培养群体的分离直接挑选法：体视显微镜喷雾法微量吸管吸法离心法