慢性hbv感染者外周血单个核细胞干扰素

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1、慢性HBV感染者外周血单个核细胞干扰素：陈瑞琳，蔺淑梅，张树林，叶峰，张曦，赵英仁【摘要】　　目的探讨慢性乙肝病毒(HBV)感染者干扰素-γ(IFN-γ)的表达水平及其影响因素。方法采用实时定量RT-PCR技术和ELISA法分别检测慢性HBV感染者外周血单个核细胞(PBMCs)中IFN-γmRNA的表达和血清IFN-γ的分泌水平；巢式PCR技术检测PBMCs中HBVDNA。结果慢性HBV感染者IFN-γ的表达和分泌水平均明显低于对照组(P<0.01，P<0.05)；慢性HBV携带者IFN-γ的表达和

2、分泌水平均显著低于HBeAg阳性组(P均<0.05)和HBeAg阴性组(P均<0.01)；HBeAg阳性组IFN-γ的表达和分泌水平均明显低于HBeAg阴性组(P均<0.01)；PBMCs中HBVDNA阳性组IFN-γ的表达和分泌水平均明显低于HBVDNA阴性组(P均<0.01)；IFN-γ表达和分泌水平与血清HBVDNA水平均呈负相关(P均<0.01)。结论慢性HBV感染者IFN-γ低表达；高病毒载量可抑制IFN-γ的表达。【关键词】乙型病毒性肝炎乙型肝炎病毒核酸(HBVDNA)

3、外周血单个核细胞干扰素-γ(IFN-γ)　　ABSTRACT:ObjectiveTostudytheexpressionofinterferon-γ(IFN-γ)inperipheralbloodmonocytes(PBMCs)inpatientsayaffectitsexpression.MethodsTheexpressionofIFN-γmRNAandsecretionofIFN-γinchronicHBVinfectiouspatientsinedbyreal-timeRT-PCRandELISA,re

4、spectively;HBVDNAinPBMCsPBMCspositivegroupthaninHBVDNAnegativegroup(P<0.01,P<0.01);theexpressionandsecretionofIFN-γountsofHBVDNAinserum(P<0.01,P<0.001).ConclusionTheexpressionofIFN-γinchronicHBVinfectiouspatientsountsofHBVDNAmayinhibittheexpressi

5、onofIFN-γ.　　KEYCs)中乙肝病毒核酸；另一份按1×107个细胞/mL加入1mLTRIzolReagent(美国invitrogen公司)，-70℃冻存，用于提总RNA。同时收集健康对照组未抗凝及抗凝血作为对照。　　1.3巢式PCR检测PBMCs中的HBVDNA　　引物设计在HBV的S基因保守序列，外侧上游引物序列：5′-CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3′，下游引物序列：5′-TTAGGGTTTAAATGTATACCC-3′；内侧上游引物序列：5′-TCTATGTTTCCCTCTTG

6、TTGC-3′，下游引物序列：5′-TACCACATCATCCATATAACTG-3′。PCR体系与反应条件：总体积25μL，包括2.5μL10×缓冲液(Buffer含20mmol/LMg2+)，1μL100μmol/LdNTPs，外侧引物各1μL(终浓度为0.2μmol/L)，待测模板5μL，TaqDNA聚合酶0.2μL(1u)，纯水补足至25μL。次轮PCR体系：取首轮PCR产物1μL作为待测模板，余与首轮PCR体系相同。PCR反应条件：预变性94℃300s、94℃60s、58℃50s、72℃60s，30个

7、循环，72℃延伸10min。扩增产物长度分别为416bp、206bp。每次实验均设阳性、阴性及空白对照。阳性对照为已知CHB患者的血清，阴性对照为正常人PBMCs中DNA，空白对照为不加模板的PCR反应体系。PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳分析。　　1.4PBMCs中总RNA的提取　　常温解冻TRIzolReagent保存的PBMCs，按TRIzol试剂说明书提取总RNA。用比色法(紫外线下吸收峰值)测定RNA浓度A260/A280比值，比值在1.8-2.0者用于后续实验。　　1.5cDNA合成及实时定量R

8、T-PCR　　用Re-vertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit(立陶宛Fermentas公司)将上述方法提取的总RNA2μg分别逆转录为cDNA。IFN-γ及内对照β-actin扩增引物均由大连TaKaRa公司设计和合成。IFN-γ上游引物：5′-GCAGCCAACCTAAGCAAG-3′(nt893-911)，下游引物：5′-TCACCTGACACAT