小鹅瘟灭活疫苗（TZ10株）的研制

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2、医博士１／丨７位级别科专ＩＫ称（）丨８）２（）２日论义提交「丨期：２年４月１２日论义答辩ＨＨ：丨８年６月ｊ学位授ｆ单位：扬州大学学位授予Ｈ期：２０１８年６月３０日＇＇答辩委员会主席ｔｋ．：ｌ＾Ｍ，＾＇＇＂＂＇＾？＾：Ｔ／．，．＼應年６月％／＾ｗ＼％Ｍ％．范娟：小鹅瘟灭活疫苗（ＴＺ１０株）的研制１．小鹅瘟灭活疫苗（ＴＺ１０株）的研制摘要小鹅癌是导致雏鹅死亡的常见疾病之一经济损失严重危害养鹅业的发，可造成巨大，展，在我国小鶴痕疫病防控过程中发挥了

3、巨大。现有弱毒活疫苗和小鹅瘟抗体的广泛应用的作用。但活毒疫苗存在毒力返强的潜在危害，从而限制了其生产应用，因此研究小鹅瘟灭活疫苗显得尤为重要。本研宄对小鹅瘟分离毒株的生物学特性进行了系统研宄，筛选出、免疫原性好、繁殖滴度高的小鹅瘟野毒株作为灭活疫苗候选株，并开展了生产工艺乳化工艺和免疫效力研宄工作、，，以期制备出安全高效的小鹅瘟灭活疫苗为我国小鹅瘟疫病的防控和净化提供有力工具。１、小鹅瘟病毒疫苗候选株的筛选？为了研制与当前小鹅瘟流行株匹配的疫苗，本研宄对从２００９２０１１年江苏省养鹅地区

4、疑似小鹅瘟的临床样品中共分离了５株鹅细小病毒（ＧＰＶ），同时对分离株进行ＶＰ３基因测ＰＶ分离株与国内大部分分离一序并绘制遗传进化树，序列分析结果表明Ｇ株属于同分支，６１明显不同于国内疫苗株ＳＹ和台湾主要分支。对获得的毒株经有限稀释法纯化，并对纯化后的病毒进行繁殖性能、毒力、特异性及免疫原性等进行了测定，５株病毒均属于强毒５Ｑａｓ／ａｏｕ／１０（ＴＺ１０（：０ＥＬＤ／０．２ｍｌ株，其中Ｇｏｓｌｉｎｇｌｕｅｖｉｒｕｔｉｚｈ）株病毒含量最高Ｆ１０代１５〇ｐｇ以上，且其灭活抗原免疫鹅４周

5、后的抗体水平最高，因此确定以ＴＺ１０株作为小鹅瘟疫苗）候选株。按照农业部颁发的《兽用生物制品（毒、虫）种种子批建立实验技术指导原则》各项要求，对纯化后的ＴＺ１０株Ｆ０代毒在鹅胚中连续传至３０代，并分别对不同代次种毒进行了ＡＧＰ、鹅胚半数致死量（ＥＬＤ５〇）测定、免疫原性、特异性实验及纯净性检验，建立了Ｆ？Ｆ２符合规定的小鶴痕病毒ＴＺ１０株的基础种子批（１６０种毒）、规定了生产用最高限制代次（Ｆ２５）。２、小鹅瘟灭活疫苗生产工艺研究疫苗生产过程中，抗原的生产工艺决定了疫苗质量及生产成

6、本，抗原的完全灭活和疫苗的乳化工艺分别是关系到疫苗安全、有效性和疫苗质量的关键步骤。本研究选取前期种子批Ｆ２５代次ＧＰＶ尿囊液，进行最佳鹅胚接种剂量与最佳鹅胚接种日龄的试验，从鹅胚死亡数统计、抗原收获量统计、病毒含量测定三方面进行比较，分别确定生产过程中最佳病毒稀释比例、接毒剂量、鹅胚日龄为：种毒用灭菌生理盐水进行１：１００倍稀释，０．２ｍｌ／胚剂量尿囊腔途径接种１１日龄非免鹅胚最佳。根据接种后不同时间鹅胚死亡数、抗原收ｎ扬州大学博士学位论文？４８１２０获量、死亡鵝胚情况和病毒含量测

7、定数据确定种毒最佳培养时间为接毒后小时，？８１４收获死亡鹅胚尿囊液；抗原最佳培养时间为接毒后４４小时，收获死亡鹅胚尿囊液及鹅胚。为了确定抗原灭活的最佳方法，对甲醛溶液的浓度、灭活时间进行了研宄，结果表°０２％３７Ｃ灭４８小时，可明：采用甲醛溶液作为灭活剂，灭活剂终浓度为．，活以完全灭活小鹅瘟病毒ＴＺ１０株。乳化工艺研宄证实：取小鹅瘟病毒ＴＺ１０株灭活抗原，按每９６份抗原加４份灭菌吐温－８０比例加吐温－８０混勾９４份注射用白油加６份，充分溶解，制成水相；－８０１３司盘，及１份硬脂酸铝，加热

8、溶解至透明灭菌，制成油相：；水相与油相的最佳配比为°？乳化过程温度控制在二次乳化的剪切速率在３０００４０００ｒ／ｍｉｎ，２５Ｃ以下，可获得最佳乳化效果。３、小鹅瘟灭活疫苗的安全性评价按照确定的小鹅瘟灭活疫苗（ＴＺ１０株）生产工艺，在实验室试制了３批灭活疫苗。将？试制的３批小鹅瘟灭活疫苗（ＴＺ１０株）通过疫苗单剂量、单剂量重复及双倍剂量免