感染慢病毒hsv1

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1、感染慢病毒HSV1：张成静陈仁富温儒民王军起陈家存郑骏年孙晓青【摘要】目的建立携带增强的突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV1-sr39tk）基因的慢病毒感染的肾癌细胞株GRC-1。方法采用改良的磷酸钙沉淀法将包装质粒、包膜蛋白质粒和含目的基因的转移质粒共转染293T包装细胞，收集的病毒上清感染GRC-1细胞。结果三质粒系统共转染293T细胞后获得较高滴度的慢病毒(2×109U/L)。经RT-PCR检测证实HSV1-sr39tk基因已导入GRC-1细胞。结论慢病毒载体可高效、稳定地感染GRC-1细胞，成功建立感染慢病毒HS

2、V1-sr39tk的肾癌细胞株GRC-1。【关键词】突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶；肾癌细胞;慢病毒载体Abstract:ObjectiveToestablishthehumanrenalcancercelllineGRC-1transfectedutantherpessimplexvirusthymidinekinase(HSV1-sr39tk).MethodsLentivirusidtransfection,i.e.,theVSV-Genvelopeexpressioncassette,the△NRFpackagingp

3、lasmidandthetransferplasmidcontainingtargetgenesphosphateprecipitation,andthecollectedlentivirussupernatantidsanrenalcancercelllineGRC-1infectedacell；lentiviralvector自杀基因疗法已经广泛应用于各种肿瘤的基础研究和临床实验性研究中。HSV1-tk/GCV系统是肿瘤自杀基因治疗中研究最为广泛且疗效得到肯定的前体药物系统。将该系统导入肿瘤细胞，从而诱导肿瘤细胞凋亡

4、，可用于肿瘤治疗的研究。本研究建立携带增强的突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV1-sr39tk）基因的慢病毒感染的肾癌细胞株GRC-1的方法。1材料和方法1.1主要材料HSV1-sr39tk由美国加利福尼亚大学SanjivS.Gambhir教授惠赠。含HSV1-sr39tk的慢病毒载体转移质粒pTK151/39tk由本室构建。人胚肾293T细胞、GRC-1细胞由本室保存。限制性内切酶、T4DNA连接酶、总RNA抽提试剂盒及RT-PCR一步法试剂盒均购自Promega公司。PCR引物由Invitrogen公司合成。1.2方

5、法1.2.1慢病毒颗粒的包装采用改良的磷酸钙沉淀法进行转染。将转移质粒（pTK151/39tk为实验组，pTK153为对照组；实验组含HSV1-sr39tk，对照组含绿色荧光蛋白）15μg、包装质粒ΔNRF10μg、包膜蛋白质粒VSV-G5μg共转染293T包装细胞，转染12h后，每日在荧光显微镜下观察对照组荧光表达情况，72h后收集上清，0.45μm滤器过滤后分装贮存于-80℃备用。1.2.2慢病毒感染GRC-1细胞及其鉴定复苏的GRC-1细胞系于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中传代培养,培养液为含青霉素1×105

6、U/L、链霉素100mg/L及体积分数为15%的小牛血清的RPMI1640。达到实验所需细胞数量后将细胞稀释成0.5×108个/L,分转24孔培养板培养24h后备转染。分2组（实验组和对照组）按6×109/L将GRC-1细胞接种至50ml培养瓶中。将上述包装好的病毒以感染复数(MOI)3∶1比例感染GRC-1细胞，培养3h后加入2mlRPMI1640完全培养液继续培养，24h重复感染，48h后在荧光显微镜下观察对照组荧光表达情况。提取感染后的GRC-1细胞的总RNA行RT-PCR。所用PCR引物序列如下：上游引物P1为5

7、′-ATGGCTTCGTACCCCGGCCAT-3′，下游引物P2为5′-TCAGTTAGCCTCCCCCATCT-3′。按RT-PCR一步法试剂盒方法建立如下反应体系：AMVITfi5×反应缓冲液10μl，dNTPs（每dNTP10mmol/L）1μl，上游引物3μl，下游引物3μl，25mmol/LMgSO42μl，AMV反转录酶（5U/μl）1μl，TfiDNA聚合酶（5U/μl）1μl，RNA样品5μl，无核酶水24μl，终体积50μl。反应条件：48℃反转录45min，94℃AMV酶灭活及RNA/cDNA/引物

8、变性2min，94℃变性30s，60℃退火1min，68℃延伸2min，共35个循环，最后68℃延伸7min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。图1对照组293T细胞转染结果（10×40）2.2慢病毒感染GRC-1细胞及HSV1-sr39tk基因在GRC-1细胞中的整合与鉴定病毒感染GRC-1细胞后24h，在倒置荧光