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1、尖锐湿疣组织中IFN【关键词】尖锐湿疣IFN-γmRNAIL-4mRNA ［Abstract］AIM:Tostudytheexpressionsofinterleukin4(IL-4)mRNAandinterferon-gamma（IFN-γ）mRNAofcondylomaacuminatainordertoobtainaclueastotheimmunologicalmechanismspossiblyrelevantforployedinsurgicallyremovedalcontrols,respectively.RESULTS:Theexpression
2、ofIFN-γmRNAinthenon-recurrentRNAintherecurrentRNAexpressionofcondylomaacuminatalesionsmightcontributetoaacuminata;interferon-gammamRNA;interleukin4mRNA 尖锐湿疣（condylomaacuminata,CA）目前尚无特效治疗方法,治疗后复发率较高,甚至迁延不愈,然而少部分患者发病后即使未经治疗皮损也可自行消退［1］,提示不同个体的免疫状态对CA的发生和复发可能有一定的影响。我们以干扰素γ（IFN-γ）代表Th1型细胞
3、因子,以白介素4(IL-4)代表Th2型细胞因子,通过原位反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法研究IFN-γmRNA和IL-4mRNA在复发性CA患者和非复发性CA患者皮损局部的表达。旨在探讨其和CA的复发的关系。 1材料和方法 1.1材料RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司;Bio-11-dUTP购自华美生物技术公司;蛋白酶K购自博士德公司。36例CA组织标本取自我院皮肤性病科患者。其中男21例,女15例:年龄21~41岁,平均年龄(28.2±4.5)岁。首次就诊的CA患者,用二氧化碳激光烧灼皮损治疗,根据其激光治疗后随访12周内是否出现新发皮疹分为未复发组
4、和复发组,其中复发组22例,未复发组14例。两组在年龄、性别和病变程度等方面均具有可比性。以15例正常包皮组织作为对照。 1.2方法 1.2.1标本制备治疗前取CA患者的皮损立即放入100mL/L甲醛溶液中固定,经透明、浸蜡、包埋,然后连续切成5μm厚切片,贴附于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上备用。 1.2.2引物合成特异性引物由日本TaKaRa公司合成:IL-4引物序列:正向5′-CTTCCCCCTCTGTTCTTCCT-3′,反向5′-GACTTTGCCGAGCTGTCCTT-3′;IFN-γ引物序列:正向5′-AGTTATATCTTGGCTTTTCA-3′
5、,反向5′-TTCGACTGATTAATAAGC-3′。 1.2.3原位RT-PCR法切片常规脱蜡至水后,用1mg/L的蛋白酶K消化组织20min,保持在25℃~37℃,95℃灭活2min后,PBS冲洗5min。30g/L过氧化氢溶液室温下阻断10min,PBS冲洗5min×3次。原位逆转录(RT)反应体系:AMV逆转录酶1μL;2×PCRBuffer25μL;MgCl2(25mmol/L)10μL;dNTP5μL;RNA酶抑制剂1μL;随机引物1μL;双蒸水7μL。置恒温箱孵育,30℃保持10min,42℃保持30min,迅速冷却至5℃。PCR反应体系:2×PC
6、R缓冲液25μL;MgCl210μL;dNTP4μL;Bio-11-dUTP2μL;Taq聚合酶1μL;上、下游引物各1μL;双蒸水6μL。循环参数:90℃变性1min,55℃保持1min,72℃保持1min,共30个循环。然后72℃延伸10min,4℃保存。50μL非免疫动物血清室温下封闭15min;链霉素抗生物素蛋白-过氧化氢酶溶液,室温下孵育15min,AEC显色液显色。阴性对照以PBS代替特异性引物作为质控标准。 1.2.4结果判定标准根据Shimizu法改良而成,AEC染色阳性细胞染成红色。着色范围以百分率记分≤1%为0,2%～20%为1,21%～50%
7、为2,≥51%为3;着色强度依据深浅记分:无着色为0,浅着色为1,深着色为2。上述两项相加为着色程度积分:≤1.9为(-),2～2.9为(+),3～3.9为(++),≥4为(+++)。 1.2.5统计学处理表达阳性率采用精确概率法（Fisher’sExactTest）进行检验;表达程度积分值采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。 2结果 不同CA组中IFN-γ和IL-4mRNA的表达程度的比较CA患者皮损中IFN-γmRNA和IL-4mRNA阳性表达产物主要位于真皮中的淋巴细胞胞质及其周围,表皮中阳性表达产物较少。对照组中IL-4mRNA和I
