弱反应性标本结果处理及报告

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1、免疫试验弱反应性标本处理及结果报告皖南医学院弋矶山医院浦春0553-5739440免疫测定弱反应性(弱阳性)的来源临床标本原因CUT-OFF值的设定一.临床标本原因可能导致假阳性结果的标本因素内源性干扰因素：类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、溶菌酶等外源性干扰因素：溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全等（一）内源性干扰因素1.类风湿因子(RF)干扰RF一般为IgM型，亦有IgG和IgA型RF具有与变性IgG产生非特异结合的特点在捕获法IgM型特异抗体的测定中表现最为明显，因为此时固相包被的抗体为抗人µ链抗体，IgM型RF的

2、存在可使其大量结合于固相。补体干扰的排除56℃30min加热可使标本中补体C1q灭活使用特异的鸡抗体IgY作为酶标或固相抗体3.异嗜性抗体的干扰天然的异嗜性抗体（IgG）可分为两类:一类（85%的假阳性由其引起）可结合于山羊、小鼠、大鼠、马和牛IgG的Fab区域，但不与兔IgG的Fab区结合。另一类（15%的假阳性由其引起）可结合于小鼠、马、牛和兔IgG的FC区表位，但不与山羊和大鼠IgG的FC区表位结合。异嗜性抗体可通过交联固相和酶标的单抗或多抗而出现假阳性反应。异嗜性抗体干扰的排除使用特异的兔F(ab’)2片段作为固相或酶标抗体。在标

3、本或标本稀释液中加入过量的动物Ig，封闭可能存在的异嗜性抗体。但加入量不足或亚类不同时无效。使用靶特异的非Ig亲和蛋白（Affibody）替代固相或酶标抗体之一。采用噬菌体展示技术展示来自单个金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）联合文库的人IgA结合亲和蛋白，用于IgA的测定，不受异嗜性抗体的影响。使用特异的鸡抗体作为固相和测定抗体。4.抗鼠Ig抗体的干扰抗鼠抗体对使用鼠源性单克隆抗体的酶免疫测定，可产生假阳性结果抗鼠Ig抗体干扰的排除使用特异的抗体F(ab’)2片段作为固相或测定酶标抗体。在标本或标本稀释液中加入过量的鼠Ig，封闭可能存在的抗

4、鼠抗体。使用特异的鸡抗体IgG作为固相和测定抗体。鸡IgG不与人抗鼠抗体反应。因而，用其作为固相或酶标抗体不会出现假阳性结果。5.溶菌酶干扰溶菌酶可与等电点较低的蛋白有强的结合能力。免疫球蛋白等电点约为5，因此，在双抗体夹心法ELISA测定中，溶菌酶可在包被的IgG和酶标的IgG间形成桥接，从而导致假阳性。溶菌酶干扰的排除为保证ELISA测定的可靠性，有必要从标本中去除溶菌酶或将其封闭，Cu2+离子和卵白蛋白可有效地封闭溶菌酶，防止其联接IgG。（二）外源性干扰因素1.标本溶血注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红蛋白，有类似过氧化物的

5、活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。2.标本被细菌污染细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用细菌的内源性酶会对测定方法产生非特异性干扰。3.标本贮存时间过长标本在2~8℃下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性。血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在－70℃以下。4.标本凝固不全血

6、液采集后，血液通常在半小时后开始凝固，18~24h完全凝固。日常检验中，常在血液还未开始凝固时即离心分离血清，此时因血液没有完全凝固，离出的“血清”并非为完全的血清，其中仍残留部分纤维蛋白原，如将其加入微孔中，在ELISA测定过程中仍可以形成肉眼可见的纤维蛋白，易造成假阳性结果血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。二.CUT-OFF值1.相关的基本概念2.CUT-OFF值与“灰区”3.结果的报告1.基本概念准确度、标准差(SD或s)、变异系数（CV）、不精密度（重复性）、测

7、定范围测定下限和测定敏感性、灵敏度、特异性阳性测定能力指数[DI(＋)]、阴性测定能力指数[DI(－)]、阳性测定的可靠性和阴性测定的可靠性基本概念标准差适用于正态分布的标准差（SD），不能泛泛地用于酶免疫测定结果的判定。这是因为阴性参考血清的酶免疫测定值的分布常为非正态分布，呈一正向偏斜。基本概念变异系数重复性（Reproducibility）：一般通过重复两次测定样本来观察。测定下限（Detectability）：是指超过零剂量精密度的最低抗原浓度，可通过t分布（一边拖尾，因为此时曲线只有上升趋势）计算在测定下限时的吸光度值的均值差。

8、测定敏感性（Sensitivity):是指一实验的测定反应对待测物质浓度变化的改变。基本概念阳性测定能力指数（DI（＋））可定义为一实验对阳性标本测定后给出阳性结果的能力（通常称为“敏感性”）