和成膜体和细胞板形成相关棉花动蛋白ghkch2具有结合微管和微丝双重作用

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1、摘要植物细胞的许多生命活动需要细胞骨架微管和微丝系统的共同参与，如囊泡和细胞器的运输，细胞分裂时早前期带的形成，以及成膜体的组织和细胞板的形成。动蛋白是一类依赖于微管的马达蛋白，以多种异型体在细胞中执行众多生物学功能，如运输囊泡和膜性细胞器，参与细胞分裂，调节微管的动态以及参与信号转导等。植物细胞中，微管与微丝之问常常发生密切联系，但其分子基础不清楚。含微丝结构域的动蛋白是否参与了微管和微丝的某些共同活动?研究这一问题，对阐述植物细胞微管、微丝间联络的分子基础具有重要的理论意义。我们利用RT-PCR和

2、RACE的方法从棉花纤维中克隆到了一个新的动蛋白基因GhKCH2。其最大开放阅读框为3,045bp，编码1,015个氨基酸，预测分子量为112kDa，等电点为7．78．对GhKCH2序列进行结构分析和同源比对，显示GhKCH2的马达区位于多肽链的中问，属于动蛋白-14家族的中间马达；其N端含有与微丝结合的CH(calponinhomology)结构域，为植物特有的动蛋白．RT-PCR结果证明它是一个在根、上胚轴、下胚轴、子叶、真叶、茎、花等各器官广泛表达的基因；在棉花纤维发育的不同时期，该基因呈现不同

3、水平的表达，以纤维细胞伸长期和次生壁增厚初期表达量为最高．在蛋白质水平对棉花动蛋白GhKCH2进行了生物化学鉴定。利用原核表达系统获得了高纯度的带有组氨酸标签的GhKCH2马达区重组蛋白M，9"”进行了微管共沉淀实验和马达区的酶活测定分析，发现M396a34与传统动蛋白相比，同样具有微管结合能力和微管激活的ATP酶活性，所不同的是其ATPase活性被微管激活的倍数明显小于传统动蛋白，达到最大酶活一半时所需的微管浓度为11lanol／L，是传统动蛋白的20倍，表现了与微管作用的低亲和力；且在核苷酸AMP

4、-PHP不存在的情况下也能与微管结合，表现出与微管结合的核苷酸不完全依赖性。对GhKCH2的非马达区原核表达产物进行了体外微管互作分析，证明GhKCH2的N端(Nl_埘)和C端(Cn9．1010多肽均有不依赖于核苷酸的微管结合能力，并能使微管成束；C-mg-101s与微管的亲和常数为0．98tanol／L，在低浓度(o一_6ttmol／L)下即表现出与微管结合的较强的亲和力；而N1．Ⅻ只有在蛋白浓度达到一定值(5～12lanol,'L)时才大量结合到微管上，表现出明显的协同效应。利用原核表达蛋白的体外

5、生化分析和植物细胞的转基因分析。在体外和体内分别研究了GhKCH2与微丝的关系。体外共沉降分析和荧光染色实验证明，GhKCH2N端多肽N14∞在体外不仅可以结合微管，还可以结合微丝，并有将微管和微丝交联到一起的能力．在拟南芥细胞和原生质体中过表达融合GFP的GhKCH2，可见绿色荧光特异分布于细胞核和胞质骨架结构上；用微管破坏药物(Oryzalin)和微丝解聚药物(cD)处理转基因原生质体，结果证明GhKCH2在体内既与微管骨架共分布，又与微丝骨架共分布。以GhKCH2的C端非马达区多肽GmIol5作

6、为抗原，制备并亲和纯化了GhKCI-12的多克隆抗体，对棉花的根尖细胞进行了免疫荧光标记。结果显示，GhKCH2的亚细胞定位与细胞周期有关。在分裂间期，GhKCH2主要定位于细胞核的核仁中：核消失后，GhKCH2呈点状分布开始在胞质中Ⅳ增多，并向细胞板位置聚集；在细胞分裂后期和胞质分裂时期，集中分布于成膜体的周围并最后定位于细胞扳上；待胞质分裂完成、核物质重新组装的时候，GlitCH2又重新回到核中定位．上述结果证明，棉花动蛋白GhKC}12具有结合微管、微丝的双重作用，与成膜体和细胞板的形成有关，可

7、能作为微管和微丝之间的动态“桥梁”起作用。关键词；动蛋白，微管，微丝，cH结构域，抗体VAbstractInplantcells，microtobuleandmicrofilamentcytoskeletonsparticipatein80rllobiologicalprocessestogether,suchastransportofvesiclesandorganelles，formationofpreprophascband,organizationandformationofphragmopl

8、astandcellplate．Kinesinisakindofmicrotubule-dependentmotorproteinsthatconstituteasupeff蛐lywithmanyisoforms．Membersofthekincsinsuperfamilyperformdiversecellular矗lncdons．suchasUamportofvesicleandmembraneorganelles,involvementincell