棉花线粒体基因组测序及其细胞质雄性不育机理的初步研究

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1、分类号：单位代码：１００１９密级：学号１０２０１０３７：Ｂ博士学位论文棉花线粒体基因组测序及其细胞质雄性不育机理的初步研究Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｇｅｎｏｍｅｓａｎｄｒｅｌｉｍｉｎａｒａｎａｌｓｉｓｏｎｐｙｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｉｎｃｏｔｔｏｎｙ研究生：李双双指导教师：教授申请学彳ａ位门类级别：农学博士＇专业名称：作物遗传育种研究方向：作物基因组学所在学院：农学与生物技术学院？２０１３年６月缩略词缩略词中文名称英文名称aa氨基酸A

2、minoacidATP三磷酸腺苷adenosinetriphosphatebp碱基对basepairsCDS编码区序列codingsequenceCef利福平rifampicinCHL氯霉素chloroamphenicolCMS细胞质雄性不育性cytoplasmicmalesterilitycpDNA叶绿体DNAchloroplastDNADEPC焦炭酸二乙酯diethypyrocarbonateEB溴化乙锭ethidiumbromideEDTA乙二胺四乙酸ethylenediaminetetraaeeticacidIPTG异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷isopropyRhi

3、o-β-d-galactosideKan卡那霉素kanamycinkb千碱基对kilobasepairsLBLB培养基lysogenybrothmitogenome线粒体基因组mitochondrialgenomeMSMS培养基murashigeandskoogmediummt线粒体mitochondrialmtDNA线粒体DNAmitochondrialDNAORF开放阅读框openreadingframePCR聚合酶链式反应polymerasechainreactionPPR聚丙烯无规共聚物pentatricopeptiderepeatPVP聚乙烯吡咯烷酮polyvinyl

4、pyrrolidoneRf恢复基因fertilityrestoringgeneRFLP限制性内切酶片段长度多态性restrictionfragmentlengthpolymorphismRT-PCR反转录PCRreversetranscriptionPCRSDS十二烷基硫酸钠sodiumdodecylsulfatetRNA转运RNAtransferRNAUTR非翻译区untranslatedregionX-gal5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-d-galactosideI摘要棉花是一种重要的经济作物。棉花具有显著的

5、杂种优势，利用杂种优势可以提高棉花的产量和品质。研究发现，细胞质雄性不育与线粒体基因组关系密切。通常比较不育系、保持系和杂交种F1的线粒体基因组、转录组和蛋白组来寻找差异，从而确定不育基因。获得基因组序列，可以直接从一级结构上分析不育机理；另外，研究不同胞质的线粒体基因组及其亲缘关系，能够为剖析棉花核质互作机制提供理论依据。本研究以哈克尼西棉胞质不育系2074A、陆地棉胞质不育系2074S、保持系2074B和恢复系E5903为材料，提取线粒体DNA，构建线粒体基因组文库，测序线粒体基因组，转基因等方面对哈克尼西棉胞质不育性和陆地棉细胞质不育性进行初步遗传分析。主要研究结果如下：

6、1、以黄化苗和愈伤组织为材料提取线粒体，用线粒体染色剂Mito-Tracker和罗丹明染色后，荧光显微镜观察发现线粒体完整且污染少。裂解线粒体，获得高质量的棉花线粒体DNA和RNA，能够满足后续试验要求。2、构建4个棉花线粒体基因组Fosmid文库，文库库容1152-2016个单克隆，平均插入片段约38kb，覆盖基因组61-108倍。3、利用28对功能基因和scaffold末端标记筛选文库，构建线粒体基因组的物理图谱。4、采用高通量测序技术对4个线粒体基因组测序，利用物理图谱和测序数据，完成4个基因组全序列，大小621.884-668.584kb，GC含量为45%，注释到37个

7、蛋白编码基因、30个tRNA和4个rRNA。基因组中包含4-7个大重复序列，末端测序阳性克隆覆盖所有的大重复序列，没有发现大重复序列介导的亚环结构。基于线粒体和叶绿体基因组的进化分析发现2074S、E5903和2074A比较近缘，而2074B与其关系较远。5、预测了4个基因组中大于300bp的ORFs，比较不育系和可育系的ORF，获得33个不育系特异存在的差异ORFs；根据已经报道不育基因的特点，最后预测了4个候选不育基因。6、通过生物信息学分析，在atp4下游发现一个不育系特有的orf16