人类胚胎肌肉细胞体外自发恶性转化抑癌基因的改变

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1、人类胚胎肌肉细胞体外自发恶性转化抑癌基因的改变【关键词】恶性转化基因肿瘤抑制肉瘤染色体9p21p53基因突变　0引言　　抑癌基因的失活或突变产物会对细胞周期增殖调控和细胞凋亡产生影响，干扰其正常周期过程，为细胞恶性转化提供潜在的基因基础．其中，比较公认的几个对细胞恶性转化影响较大的基因有周期素依赖性蛋白激酶抑制家族CDKI、Rb和p53等［1，2］．目前，体外培养人类细胞自发恶性转化的报道很少［3-7］，近期的研究发现，体外长期培养的间充质干细胞会发生恶性转化，其机制不清，可能与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关，研究发现p16基因的失活和cmyc基因扩增在其中发挥作用［4-5］．我们

2、通过正常人类胚胎肌肉细胞培养获得能稳定传代的自发恶性转化细胞系，该类细胞系通过免疫组化及病理研究发现其体内可表现为纤维肉瘤、软骨肉瘤及横纹肌肉瘤的特性（前期研究数据证实）［8］．我们对6个胚胎自发恶性转化细胞系（5个不同遗传背景）的研究发现，其在9p21处存在片段缺失．在对p53基因的分析上，对其突变频率较高的外显子7，8测序发现突变率高达13％，而内含子7更与正常序列无明显相似性.且在测序的6个样本中具有具有高度的一致性，提示其可能存在一共同的突变机制及较强的选择优势．　　1材料和方法　　1.1细胞培养人类胚胎肌肉细胞原代培养和传代方法参考文献［8］．在取材5个不同遗传背景胚胎肌肉进

3、行培养4~7mo后自发恶性转化，并能稳定维持体外长期传代,至今恶性转化的细胞体外培养已达1-3a．其中有2个细胞系来自同一个胚胎肌肉细胞的不同培养时期恶性转化，命名为MS5B和MS5C.其它4个细胞系分别命名为MS0812,MS0504,MS3,MS4.MS0812和MS0504细胞系的性质在我们的前期研究中已经有报道［8］．　　1.2基因组DNA的提取采用宝生物公司的UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0（TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.,Ltd.），按使用说明规范操作．　　1.3PCR扩增缺失分析对6个细胞系的p1

4、6基因外显子1,2,3，p15基因外显子1及MTAP外显子2~7进行扩增，阳性对照为正常胚胎肌肉细胞．阳性模板质控为βactin．50×反应体系，10mmol/LTris(pH8.6),50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgCl2,0.2mmol/LdNTPs,0.4mmol/L引物，50ngDNA模板,5单位Taq聚合酶(TaKaRaTaqTM,TaKaRaBiotechnologyCo.,Ltd.)．反应条件及引物序列见表1．产物于20g/L琼脂糖上电泳后置紫外分析仪照相．　　表1引物序列（略）　　1.4p53外显子（7－8）测序对6个胚胎自发恶性转化肌肉细胞系（MS08

5、12,MS0504,MS3,MS4,MS5B,MS5C）提取DNA,扩增p53外显子7,8，PCR产物送上海生工公司纯化后直接测序［9］，测序仪为ABIPRISM3730，测序染料为BigDyeterminator．　　1.5p16免疫组化将肿瘤细胞接种于35mm培养皿，待细胞贴壁饱和度80％左右，弃去培养基，按单层贴壁细胞免疫组化实验步骤操作，一抗为20倍稀释的鼠抗p16mAb（北京中衫金桥生物技术有限公司），应用AEC染色法进行显色后照相，阳性对照用人正常胚胎肌肉细胞．　　2结果　　2.1肿瘤细胞系9p21处片段缺失在６个样本的PCR扩增中都出现p16外显子1,2,3，p15外显子

6、1及MTAP外显子4,5,6,7的纯合性缺失（图1A-D）．而MTAP外显子2,3则有模糊条带及非特异性扩增（图未示），正常对照则无非特异性扩增（图1E），提示其可能在附近存在断裂位点．　　A:p16外显子1纯合性缺失(B,C和D模板顺序与A相同)；B：p16外显子2纯合性缺失;C：p16外显子3纯合性缺失;D:p15外显子1纯合性缺失；E:正常肌肉细胞MTAP外显子2~7；F:各细胞系质控βactin.M：marker:1:正常胚胎肌肉细胞;2:MS0812;3:MS0504;4:MS3;5:MS4;6:MS5B;7:MS5C.　　图1肿瘤细胞系9p21处片段缺失（略）　　2.2p

7、16免疫组化阳性对照正常胚胎肌肉细胞可见胞质泛染(图2A)，而肉瘤细胞系则显示阴性(图2B).　　A：正常胚胎肌肉细胞阳性；B：肉瘤细胞系.　　图2p16免疫组化阴性（MS3细胞系）（略）　　2.3p53外显子7,8及内含子7测序在对6个样本（MS0812,MS0504,MS3,MS4,MS5B,MS5C）的p53外显子7－8测序发现其外显子7与正常p53序列比对其同源性为92％，外显子8为86％左右，内含子7与正常p53序列比对部分几无明显相