遗传学实验_甜蜜素对蚕豆微核形成影响

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1、诱变物质的微核检测技术摘要通过使用不同浓度的甜蜜素对蚕豆和大蒜进行培养，以检测甜蜜素的毒性强弱。1.引言微核：间期细胞的细胞质中一个或多个圆形或杏仁状结构。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具有合成DNA的能力。微核是染色体畸变的一种表现方式。引起染色体断裂的因素分为物理因素和化学因素。物理因素包括：具有能量的各种射线，如α射线，β射线，γ射线，X-ray，中子，质子，UV等。化学因素包括：诱变剂和重金属等。经典断裂剂：Ｘ射线。诱变剂：环磷酰胺、氧化铬CrO3、叠氮化钠NaN3、甲基璜酸乙酯EMS、硫酸二乙酯。微核发生率同作用因子的剂量呈正相关。微核技术获

2、得的结果与通过中期畸变染色体计数所获结果相当。甜蜜素，其化学名称为环己基氨基磺酸钠，是食品生产中常用的添加剂。甜蜜素是一种常用甜味剂，其甜度是蔗糖的30～40倍。消费者如果经常食用甜蜜素含量超标的饮料或其他食品，就会因摄入过量对人体的肝脏和神经系统造成危害，特别是对代谢排毒的能力较弱的老人、孕妇、小孩危害更明显。[1]甜蜜素在人体内不能被新陈代谢，但肠内细菌可使之降解为环己胺，而环己胺是致癌物质。1969年，有人报道，其对大鼠可诱发膀胱癌，该试验也获得了日本有关部门的认可，美国FDA禁止其加入食品或作为食品添加剂。孟加拉国在2007年开始禁止使用甜蜜素作为食品添加剂

3、。而欧盟也在2000年和2003年两次调整甜蜜素的最高限定值。而我国至今仍然没有调整甜蜜素的限定值，其已经超过欧盟限定值的2.5倍。美国FDA明文禁止我们使用甜蜜素。至今世界上明确准用的有中国、欧盟、德国等80多国；而明确禁用的有日本、美国等45国。[2]2.实验材料2.1实验材料大蒜，蚕豆，甜蜜素，0.1mol/LNaN3，1mol/L盐酸,酒精，乙酸，水，纱布，培养皿，改良苯酚品红,载玻片，盖玻片，解剖针，显微镜，刀片。2.2实验方法2.2.1材料的获取及处理取材：大蒜：于24℃水中浸泡24-36h,选择根长整齐一致，不定根长约0.5－1cm左右的大蒜随机分组。

4、蚕豆：于24℃水中浸泡36h,湿纱布包裹催芽36h,选已发芽的蚕豆放入垫有湿脱脂棉的培养皿中培养36h,每12h用水冲洗1次,换水培养。选择根长整齐一致,根长约1.0～1.5cm的蚕豆随机分组。培养：将蚕豆、大蒜分别分为五组，分别用水、0.175g/ml甜蜜素、1.75×10-2g/ml甜蜜素、1.75×10-3g/ml甜蜜素和叠氮化钠培养。用40mmol/L的叠氮化钠培养大蒜，用20mmol/L的叠氮化钠培养蚕豆。同时同条件培养24小时。之后清水恢复培养24小时，用卡诺固定液最后固定24小时，再用70%的乙醇4℃下保存。解离：固定后的材料用清水洗涤后，大蒜用1MH

5、Cl处理10min，水洗三次；蚕豆28℃下根尖用5MHCl处理25-50min,水洗3次。在酸解过程中一定要掌握好温度和时间，若解离不够，则压片不易分散。若解离太过，在下一步处理材料时由于材料过软而易丢失。然后水洗3次。染色：大蒜切取近根尖分生区的伸长区组织，用改良苯酚品红染色10min。蚕豆切取近根尖分生区的伸长区组织，捣碎，用改良苯酚品红染色20min。2.2.2染液的制备改良苯酚品红，其制备过程如下：原液A3g碱性品红溶于100ml70%乙醇中。原液B取原液A10ml加入90ml5%的苯酚水溶液。取原液B45ml加入6ml冰乙酸和6ml37%的甲醛。（适合于植

6、物原生质培养中的细胞核染色）取2-10ml染色液，加90-98ml45%的醋酸1.8g山梨醇。（适合于细胞核的染色，只有细胞核及染色体被染成紫红色，而细胞质不着色）2.2.3制片及镜检压片：加上盖玻片后，用铅笔轻敲使细胞分散，最后垂直压下去。镜检：每个根尖计数1000个细胞，统计含微核的细胞数，然后取平均值，即为该处理的微核千分率。3.结果0.175(203g/kg)甜蜜素由于浓度过大，导致细胞脱水死亡，蚕豆、大蒜都未能成功存活。蚕豆中其他组可能由于处理时解离时间不充分，以及染色时间不足未能成功染色，造成无法观察细胞结果。实验失败。大蒜组实验结果良好：培养溶液(g/

7、ml)水1.75×10-3(2.03g/kg)甜蜜素1.75×10-2(20.3g/kg)甜蜜素0.175(203g/kg)甜蜜素40mmol/L的叠氮化钠微核率（‰）01030死亡比率并不是很大表格1大蒜组微核实验结果图表1GB2760-2011食品安全国家标准食品添加剂使用标准[3]由上表可知，液体类食品中，甜蜜素的最大使用量为0.65g/kg。试验中浓度最低为2.03g/kg，其微核率为10‰,有效最高浓度为20.3g/kg，相对应的微核率为30‰，根据“微核发生率同作用因子的剂量呈正相关”，由此估算，液体类食品中，当其浓度为0.65g/kg时，其微核率为