pcr常见问题课件

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1、PCR常见问题、原因分析及其对策北京天为时代科技有限公司PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略PCR常见问题、原因分析及其解决方案PCR常见问题无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性PCR常见问题之一无扩增产物模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短原因对策纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照

2、有条带，而样品则无；PCR常见问题之二非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。PCR常见问题之二引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多原因对策重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数非特异性扩增PCR常见问题之三拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。M12PCR常见问题之三模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2

3、+浓度偏高循环次数过多原因对策纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数拖尾PCR常见问题之四假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染现象：空白对照出现目的扩增产物对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。PCR技术简介PCR常见问题、原因分析及其解决方案提高PCR反应特异性的策略提高PCR反应特异性的

4、策略巢式PCR（Nest-PCR）四种策略递减PCR（TouchDownPCR）热启动PCR（HotStartPCR）使用PCR增强剂策略之一巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。策略之二递减PCR（TouchDownPCR）递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然

5、后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。策略之三热启动PCR（HotStartPCR）热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度；现在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。策略之四使用PCR增强剂

6、甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。增强剂浓度要适当谢谢！北京天为时代科技有限公司http//www.tw-biotech.com免费咨询：800－810－2177石家庄总代：石家庄拜昂生物技术有限公司联系电话：0311－66711286052086