嗜酸氧化硫硫杆菌分离鉴定

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1、嗜酸氧化硫硫杆菌的分离鉴定嗜酸氧化硫硫杆菌[78]（AcidithiobacillusthiooxidansAt.t）是一类硫氧化细菌的总称，它们在形态学和生理学上存在着多样性，而且可能是不同种类的细菌[79]。嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillusferrooxidans,At.f）和嗜酸氧化硫硫杆菌是目前在生物冶金方面研究最多、最重要的两种菌。氧化亚铁硫杆菌利用铁源浸矿时会在矿物表面形成硫层，阻碍进一步浸矿，而嗜酸氧化硫硫杆菌却可以利用硫，将阻碍浸矿的硫层除去[80]，因而它在浸矿中的作用尤为重要。本文从土壤样品中分

2、离纯化出了一株硫氧化细菌，对其进行了形态学、生理生化特征和16SrDNA鉴定和分析，为后面探讨其浸矿机理奠定基础。鉴定结果表明此菌属于嗜酸氧化硫硫杆菌，命名为HY-01。2.1试剂与材料2.1.1菌种来源实验所用菌株为本实验室从湖北大冶铜山口酸性土壤中分离所得；大肠杆菌为本实验室保存菌种。2.1.2主要试剂升华硫，化学纯，天津市福晨化学试剂厂；琼脂粉，生化试剂，国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨，生化试剂，日本进口；酵母抽提物，生化试剂，日本进口；二苯胺磺酸钠，化学纯，国营昆山化工试剂厂；乙二胺四乙酸钠，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公

3、司；其余试剂均为国药集团化学试剂有限公司分析纯。2.1.3培养基实验室使用的各种培养基配方如下：Waksman培养基[81]：(NH4)2SO40.2g，K2HPO4·3H2O3.0g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCl2·2H2O0.126g，S010.0g，蒸馏水1000mL，pH=2.0。Starky-Na2S2O3-琼脂培养基[81]：(NH4)2SO42.0g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCl2·2H2O0.25g，KH2PO43.0g，FeSO4·7H2O0.001g，Na2S2O310g，琼脂3.0g，蒸馏水10

4、00mL。基础培养基：(NH4)2SO40.2g，K2HPO4·3H2O3.0g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCl2·2H2O0.126g，蒸馏水1000mL，pH=2.0。LB培养基：1g蛋白胨，0.5g酵母提取物，1gNaCl，溶于100mL蒸馏水中，pH=7.0。2.1.4缓冲液[1]STE缓冲液：Tris-HCl（pH7.6）0.2mol/L，NaCl0.5mol/L，SDS0.1%，EDTA0.01mol/L；[2]TE缓冲液：Tris-HCl10mmol/L（pH7.6），EDTA0.001mol/L；[3]50×TA

5、E缓冲液：242gTris碱，57.1mL冰醋酸，100mL0.5mol/mLEDTA(pH8.0)，加双蒸水至1L。电泳缓冲液常用0.5×TAE缓冲液；[4]10%SDS溶液：10%（w/w）的十二烷基磺酸钠溶解于蒸馏水中，可加热到68℃溶解。[5]醋酸铵缓冲液：取醋酸铵100g，加水300mL使溶解，加冰醋酸7mL，摇均即得。2.1.5酶及试剂盒[1]酶：TaqDNA聚合酶购自武汉鼎国生物技术有限公司，T4DNA连接酶购自Takara公司，溶菌酶，蛋白酶K，Rnase，均为上海生工产品。[2]试剂盒：PCR产物纯化试剂盒，GenEx

6、tractTM质粒小量快速提取试剂盒，PMD-18Vector连接试剂盒，均为Takara公司产品；DNAMarker(DL2,000)，Loadingbuffer购自武汉鼎国生物技术有限公司。2.1.6引物合成与测序扩增16SrDNA的PCR扩增引物为：Pf：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'Pr：5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'引物由武汉鼎国生物技术有限公司合成，测序由六合华大基因科技股份有限公司完成。2.1.7主要仪器设备表2.1主要仪器与设备Table2.1Themainequipments型号

7、名称生产厂家3K30型台式冷冻离心机SIGMASPX-250B-Z型生化培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂HZ200LB型恒温培养摇床武汉瑞华仪器设备责任有限公司UV-2000型紫外-可见分光光度计龙尼柯（上海）仪器有限公司DELTA320pH计Mettle-ToledoGroup（上海）有限公司YX280A手提式不锈钢蒸汽消毒器上海三申医疗器械有限公司85-2型磁力恒温搅拌器上海司乐仪器厂FM70型制冰机格兰特公司PCR仪德国eppendorf公司3K30台式冷冻离心机SIGMA2.2试验方法2.2.1土样采集与处理将取样瓶与取样勺

8、用牛皮纸炸好后，于121℃高压灭菌。在取样地点打开牛皮纸，用取样勺取土壤样品至取样瓶中，瓶口在酒精灯焰上灼烧，然后迅速扎好牛皮纸带回。称取土样10g到盛有100mL无菌水的烧杯中，加入磁力搅拌子，在磁力搅拌