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《羟基磷灰石和壳聚糖制备微米级微球支架》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、羟基磷灰石和壳聚糖制备微米级微球支架 运用组织工程骨进行骨组织再生修复已成为当下研究的热点之一。而生物支架在骨缺损的修复过程中起到关键性作用，被誉为组织工程的基石.复合类仿生支架（有机物与无机物结合）可以模拟天然成熟骨组织的结构，在促进干细胞增殖、骨向分化等方面具有显着优势[1].羟基磷灰石（hydroxyapatite,HAp）作为人体骨骼和牙齿的主要组成，生物相容性良好，并有足够的机械强度可承受体内压力；纳米级HAp利于成骨细胞黏附，具有骨诱导性，常被作为仿生支架的制备原料[2].壳聚糖（chito
2、san,CS）作为一种天然的再生聚合物，生物性能佳，易于化学改性并对体内大分子有高度亲和性，是一类颇有前景的组织工程支架材料[3].该研究采用微流体技术将纳米HAp和CS制备成微米级微球支架，并通过一系列细胞学实验评估其作为组织工程支架的生物学作用。 1材料与方法 1.1材料及设备 1.1.1实验动物与试剂SPF级雄性4周龄SD大鼠20只，由安徽医科大学实验动物中心提供。微球制备相关试剂（国药集团化学试剂有限公司）,高糖型DMEM（美国Invitrogen公司）,胎牛血清（FBS）（中国四季青公司）
3、,异硫氰酸标记的鬼笔环肽（FITC-Phalloidin）、DAPI（美国Sigma公司）,琼脂糖（美国Solarbio公司）. 1.1.2主要仪器微量进样泵（中国兰格恒流泵有限公司）,pH计（PHS-3B,中国上海虹益公司）,Countstar自动细胞计数仪（IC1000,中国上海睿钰生物科技有限公司）,荧光倒置显微镜（DMI3000B,德国Leica公司）,场发射扫描电子显微镜（JSM-6700F,日本JEOL电子公司）,共聚焦扫描式显微镜（SP5-DMI6000-DIC,德国Leica公司）.
4、1.2方法 1.2.1HAp纳米颗粒合成5mmol尿素溶于20ml乙醇与水（3∶1）混合溶液中，加入CaCl2（0.1mol/L,8.35ml）与NaH2PO4（0.1mol/L,5ml）,pH值调至11.9.搅拌30min,置于80℃烘箱24h.产物洗涤冻干备用。 1.2.2复合微球制备及显微镜下形态学观察CS及HAp各40mg加入19.6ml蒸馏水中，超声破碎20min,所得HAp-CS混合溶液作为内相，环己烷溶液（含3%司班80）作为挤出相。利用微量进样泵控制两相挤出速度，外向1ml/min,内
5、相0.05ml/min,进行微球制备，NaOH乙醇溶液（0.4mol/L）进行收集固化，所得HAp-CS复合微球蒸馏水反复清洗，显微镜下观察微球形态。 1.2.4细胞黏附率及增殖率微球高温高压灭菌了，与P2代骨髓间充质干细胞（bonemarroesen-chymalstemcells,BMSCs）体外共培养。黏附率：细胞与微球复合之比为50∶1（细胞初始浓度为C0=5104/ml）.设置3个复管，置于培养摇床上，先动态培养5min,后静置30min,交替进行6h.1、2、3、4、5、6h等6个时间点，分
6、别吸取1ml细胞微球混合溶液，静置1min,上清液中的游离细胞计数为Ct,黏附率为（C0-Ct）/C0100%.取3个复管平均值。增殖率：前6h动静态交替培养操作同上，设置3个复管。1、3、6、9d时，取1ml细胞微球混悬液，静置后吸除上清液，PBS清洗3次，胰酶消化，定容至1ml,细胞和微球均计数，细胞浓度为C,每毫升微球数为N,二者之比为C/N,该数值随时间的增长体现了细胞在微球上的增殖。3个复管所得值求平均数。共2页:12 1.2.5扫描电镜观察BMSCs与微球支架的复合状态细胞材料复合1、3、6
7、、9d后，每种材料各取1ml细胞材料混悬液，PBS清洗3次，2.5%戊二醛室温固定30min,冷冻干燥后进行扫描电镜观察。 1.2.6细胞骨架染色及共聚焦扫描式显微镜观察细胞材料复合后6d,取1ml细胞材料混悬液，PBS轻缓清洗3次，4%多聚甲醛室温固定20min,PBS清洗（5min3）.FITC-Phalloidin（5μg/ml）避光染色40min.PBS清洗10min,清洗3次。DAPI（1μg/ml）避光染5min.PBS洗3次。共聚焦扫描式显微镜观察。 1.2.7体外模具实验6
8、cm培养皿中加入5ml高温高压灭菌的2%琼脂糖后，其厚度为2mm.待其凝固后，使用直径为5mm的打孔器，琼脂糖上便形成直径为5mm、厚度为2mm的圆形缺损，与标准骨缺损尺寸吻合。将细胞和微球共培养1d后填充至上述模具中，表面盖筛X，加入5ml培养液，每2~3d换一次液，培养14~21d,观察组织块形成情况。 2结果 2.1显微镜下微球形态观察将所制备的HAp-CS复合微球分散在水中，显微镜下可见其表面光滑，粒径均匀，大小为
