定点突变操作步骤

《定点突变操作步骤》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、Muta-direct™定点突变试剂盒操作方法[A]诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct™酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。1.设计点突变引物。[注]参考引物设计指导2.准备模板质粒DNA[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。在end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。3.[选项]对照反应体系（50μl反应体系）10×ReactionBuffer5μlpUC18

2、controlplasmid（10ng/μl,total20ng）2μlControlprimermix（20pmol/μl）2μldNTPmixture（each2.5mM）2μlddH2O38μlMuta-direct™Enzyme1μl4.样品反应体系（50μl反应体系）10×ReactionBuffer5μlSampleplasmid（10ng/μl，total20ng）2μlSampleprimer(F)（10pmol/μl）1μlSampleprimer(R)（10pmol/μl）1μld

3、NTPmixture（each2.5mM）2μlddH2O38μlMuta-direct™Enzyme1μl5.PCR反应条件[注]按如下参数设置PCR扩增条件。CyclesTemperatureReactionTime1cycle95℃30sec15cycle95℃55℃72℃30sec1min1minperplasmidKb6.PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。[注]按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。Mu

4、tationCycles1~2Nucleotide15cycles3Nucleotides18cycles[B]突变质粒选择PCR反应结束后使用Mutazyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。1.准备PCR反应产物。2.加入1μl（10U/μl）Mutazyme™酶37℃温育1小时。[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme™酶可能发生与样品反应不完全的现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme™酶用量。[C]转化反

5、应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株，例如DH5α。1.将10μl样品加到50μl感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟。2.接下来可以参照一般的转化步骤进行。序列分析通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。突变实例以GGC→GAC为例[突变反应体系]10×ReactionBuffer5μlSampleplasmid（6.3Kb，10ng/μl，total20ng）2μlSampleprime

6、r（F）（10pmol/μl）1μlSampleprimer（R）（10pmol/μl）1μldNTPmixture（2.5mMeach）2μldH2O38μlMuta-direct™Enzyme1μl[PCR条件]CyclesTemperatureReactionTime1cycle95℃30sec15cycle95℃55℃72℃30sec1min1minperplasmidKb[序列分析]突变质粒测序结果常见问题解决方案无单菌落出现通过电泳检测PCR反应体系如果是PCR反应的问题可以通过调节退火温

7、度进行解决检测感受态细胞的转化效率突变率低Mutazyme™酶处理不当增加Mutazyme™酶用量或延长反应时间检查模板质粒用量质粒用量过多会引起突变率降低错误突变检测合成引物的质量