两株苯酚降解菌联合pgpr对番茄根际土壤中苯酚降解和植物生长

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1、两株苯酚降解菌联合PGPR对番茄根际土壤中苯酚降解和植物生长第二章苯酚降解菌的分离、鉴定及其降解能力的测定我国每年有大量的原油及其加工品流入环境，能够改变土壤有机质的组成和结构，影响作物发育，同时通过生长于该土壤中的植物及其产品，能以食物链方式影响到人类的身体健康。在石油污染物中，苯酚作为模式污染物受到相当的重视。根据美国环境监察局要求，自然水体，陆地和城市排水中允许存在的苯酚含量是0.5mg/L。同时苯酚是一种高挥发性的有机物，广泛存在于工业产品，同时也可以自然存在，如某些食物和人畜粪便中（尿液中含有0.5-80mg/L苯酚）。苯酚在日常生活中也非常常见，如杀菌消毒

2、剂、漱口水、治疗咽喉、痔疮和某些神经疾病的药物中，而木材燃烧、汽车尾气和吸烟也都有苯酚产生，另外苯酚作为大量有机化合物生物转化的中间产物或终产物在环境治理方面也非常重要。微生物高速度的繁殖特性和遗传变异性使它的酶体系能够以最快的速度适应外界环境的变化从而显示出其在环境治理上的高效性和多样性。本章从上海市奉贤区大田作物根际土壤、苔藓土、园艺土和石油浸润土壤这四种土壤样品中进行了苯酚降解菌的分离筛选，运用16SrDNA序列分析与NCBI上已知序列进行比对，确定菌株的种类。为了在后续的实验中更好的运用，本研究随后对菌株在培养基中以及在土壤中的苯酚降解能力分别进行了测定，挑选

3、了最优的菌株进行后续研究。1实验样品与材料1.1土壤样品本章所用土壤样品为上海市奉贤区大田作物根际土壤、苔藓土、园艺土和石油浸润土壤。1.2仪器和设备常规塑料器皿、接种环、玻璃器皿、移液枪、电子天平、超净工作台、分光光度计、台式摇床、精密pH计、振荡器、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、恒温水浴锅、PCR仪、振荡器、水平DNA电泳槽、电泳仪、紫外凝胶成像系统。1.3主要试剂实验用水为新鲜的蒸馏两次的双蒸水，所用各试剂均为AR.级别的试剂。用于PCR扩增的试剂购于Takara生物工程有限公司。16SrDNA序列扩增引物由上海生工生物技术有限公司合成。16SrDNA序列的测定工

4、作由上海美吉生物医药科技有限公司完成。1.3.14-氨基安替比林直接分光光度法测定所用试剂1）无酚水在每1000mL双蒸水中加入0.2g经200℃恒温活化30min的粉末状活性炭，震荡摇匀后静置过夜，用双层滤纸过滤后置于玻璃瓶中，使用时避开橡胶制品。2）苯酚标准贮备液将1.0g苯酚加入至灭菌过的无酚水中，定容至1000mL，溶液浓度为1mg/mL。将此溶液贮存于棕色瓶中，4℃冰箱避光保存，可稳定保存一个月。3）苯酚标准中间液按试验需求取适量苯酚标准贮备液，加入灭菌过的无酚水中稀释，使苯酚浓度达到0.01mg/mL，此溶液不可保存，当天使用当天配置。4）缓冲溶液称取20

5、.0NH4Cl溶于浓氨水中，并定容至100mL，置于冰箱密闭冷藏保存，pH约为10.0，浓氨水具有较强的挥发性，配置应快速完成，并尽量处在低温条件下，根据实际情况配置，最好当天使用当天配置，防止由于氨的挥发导致浓度和pH变化。5）4-氨基安替比林溶液称取2.0g4-氨基安替比林溶于灭菌过的无酚水中，并定容至100mL。将此溶液贮存于棕色瓶中，4℃冰箱避光保存，可稳定保存一周，最好当天使用当天配置。6）铁氰化钾溶液称取8.0g铁氰化钾溶于灭菌过的无酚水中，并定容至100mL。将此溶液贮存于棕色瓶中，4℃冰箱避光保存，可稳定保存一周，最好当天使用当天配置。1.3.2电泳试

6、剂1）50×TAE电泳缓冲液称取冰醋酸557.1mL、Tris碱242.0g、EDTA（0.5M，pH8.0）100mL，用双蒸水定容至1000mL，使用时稀释50倍。2）EB溶液将此溶液（0.5mg/L）贮存于棕色瓶中，室温下避光保存，EB有剧毒，实验室操作时必须戴手套。1.4培养基1.4.1富集培养基牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g,氯化钠5.0g,苯酚200mg，用双蒸水定容至1000mL，pH调节至7.0-7.2，苯酚在培养基灭菌后于超净台无菌环境加入。1.4.2无机盐筛选培养基（MSM）KHXPO40.5g，K2HPO40.5g，MgSO4•7H2O0.2g

7、,CaCl20.1g，NaCl0.2g，NH4NO41.0g,微量元素1mL，用双蒸水定容至1000mL，苯酚按试验需要量添加。微量元素为FeSO4•7H2OO.2g,MnSO40.065g,ZnSO4•7H2O0.04g，CoCl20.1g，用双蒸水定容至1000mL，在每1000mL的无机盐筛选培养基中加入1mL微量元素，苯酚均在培养基灭菌后于超净台无菌环境中加入。1.4.3无机盐固体培养基在1.2.2描述的培养基中加入1.5%-2.0%的琼脂。2实验方法2.1苯酚降解菌株的富集筛选取土壤样品（1g/份）加入50mL无菌双蒸水震荡摇匀，制成土壤悬