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1、抗KDR胞内区(KDR：李丽英,彭晓东,章崇杰,董立华,潘英,王凡【摘要】 目的:研制特异性针对肿瘤新生血管内皮细胞生长因子受体(或含激酶插入区受体)胞内区（KDR-CD）的特异性单克隆抗体（mAb)。方法:以谷胱甘肽转硫酶耦联的KDR-CD(GST-KDR-CD)可溶性融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备分泌抗KDR-CDmAb的杂交瘤细胞;用间接ELISA法测定其亲和力、亚类,r)为200×103～230×103。KDR胞外区与VEGF-A结合后,导致受体构象改变并发生二聚体化,进而诱导胞内区的酪氨酸残基自
2、动磷酸化和细胞内信号蛋白的酪氨酸磷酸化,从而介导VEGF-A完成其重要的生物学功能。研究证明,靶向敲除编码KDR的基因,将导致小鼠胚胎第8.5～9.5天死亡,并出现血岛形成损伤和缺乏成熟的ECs［3］;在成年小鼠中,即使是通过药物短期阻断VEGF-A与KDR之间的相互作用,仍然会引起血管退化［4］。目前国内外都有关于研究抗KDR单克隆抗体(mAb)的报道,但都是针对KDR胞外区域,如邵晓枫等［5］制备的抗KDR3mAb。研究显示,针对KDR胞外区域的mAb,其抑制ECs增殖及血管形成的活性较低。鉴于KDR-CD(acytop
3、lasmicdomainofhumankinaseinsertdomaincontainingreceptor)在VEGF-A/KDR信号通路中的重要作用,我们用杂交瘤技术制备能稳定分泌抗KDR-CDmAb的杂交瘤细胞,以期获得能抑制VEGF-A生物学效应的抗KDR-CDmAb。 1材料和方法 1.1材料BALB/c小鼠(8～10周龄,体质量18～20g,雌性,清洁级)由四川大学实验动物中心提供;小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14、HUEVC,由四川大学华西基础医学和法医学院免疫学研究室提供;GST纯化蛋白、GST-KD
4、R-CD融合蛋白（Mr约45×103）由四川辉阳生命工程公司馈赠;次黄嘌呤H、氨基喋呤A、胸腺嘧啶T（HAT）,聚乙二醇购自美国Sigma公司;辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自Rocland公司;HRP-STREPTAVIDIN购自北京中山公司;小鼠的mAbIg检测试剂盒购自HBT公司;高Mrmarker购自Fermentas公司。 1.2方法 1.2.1杂交瘤细胞株的建立用纯化的GST-KDR-CD蛋白作为免疫原,常规皮下免疫BALB/c小鼠2只,50μg/(只·次),共4次;末次加强免疫后3d,取
5、小鼠脾脏通过机械分离法制成脾细胞悬液,与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14在聚乙二醇(PEG)介导下融合,采用杂交瘤技术建立分泌抗KDR-CDmAb的杂交瘤细胞株。 1.2.2mAb的大量制备及纯化每只BALB/c小鼠腹腔内注射0.5mL液体石蜡,7d后将建株的杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔（5×106细胞/只）。10～14d后收集腹水,按饱和硫酸铵法进行盐析,G-Sephrose4B亲和层析纯化,用紫外分光光度计测定其蛋白浓度。 1.2.3mAb的Ig亚类鉴定按照HBT公司的小鼠mAb亚类检测试剂盒说明书进行。在分别放有不同
6、类及亚类检测试纸条的玻璃管中,相继加入缓冲液、待检mAb及其相应类及亚类的检测抗体,轻轻振荡试管,直至检测试纸条上出现斑点。 1.2.4mAb的特异性鉴定采用rmarker、GST蛋白、GST-KDR-CD蛋白、HUEVC裂解液,进行SDS-PAGE电泳分离。电泳完毕,将凝胶覆盖于NC膜上,进行转移电泳。转膜完毕,剪下Marker所在的NC膜,用氨基黑10B染色。其余NC膜用50g/L脱脂牛奶封闭,相继加入抗KDR-CDmAb、生物素化山羊抗鼠IgG、HRP-STREPTAVIDIN,最后做化学发光免疫分析(chemilu
7、minesenceimmuno,CLIA）。 1.2.5KDR-CD的基因序列KDR-CD的基因序列为5′-TTAAACAGGAGGAGAGCTCAGTGTGGTCCCCGAGTCAGGCTGGAGAA-TCTGGGCTGTGCTACCGGTTTGCACTCCAATCTCTATCAGCTTTAA- AAGTTCTGCTTCCTCACTGGAGTACACGGTGGTGTCTGTGTCATCG-GAGTGATATCCGGACTGGTAGCCGCTTGTCTGGTTTGAGCCTT- CAGATGCCACAGACTCCCTGCT
8、TTTGCTGGGCACCATTCCACC- AAAAGATGGAGATAATTTGGTTCTGTCTTCCAAAGTTTTCAGC- TCTTCTGAGGCAAGAACCATACCACTGTCCGTCTGGTTGTCAT-CTGGGATTACTTTTACTTCTGGTTCTTCTAACG
