细胞与酶固定化

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1、第一节概述第二节酶固定化第三节微生物、植物和动物细胞固定化第四节原生质体固定化第四章酶与细胞固定化一、酶与细胞固定化的概念二、天然酶在应用中的一些缺陷三、固定化酶特点四、固定化酶的发展史第一节概述一、酶与细胞固定化的概念借助各种物理或化学方法，将酶或细胞固定于水不溶性载体上的过程，称为酶与细胞固定化。水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术二、天然酶在应用中的一些缺陷1、酶稳定性差，易变性失活2、酶和底物只能反应一次，难于回收利用，不仅成本高，而且难于连续化生产。3、反应液中混入酶蛋白，使产品的分离纯化复杂化。研究固定化酶，可使酶在应用上的这些不

2、足得到改善。1、不溶于水:反应完成后，经过滤或离心等简单分离，就可以回收，以重复使用，降低酶制剂成本。2、具有一定的机械强度:可将其装成酶柱，当底物溶液缓缓流经酶柱时，就能发生酶促反应，流出液中，即含有酶促反应产物，其产物不易带杂质，收率高，易精制。3、稳定性提高:一根酶柱往往可以连续使用数十次，而酶活力并无明显下降。三、固定化酶特点：四固定化酶的发展史固定化酶(ImmobilizedEnzyme）是20世纪60年代发展起来的—项新技术。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化

3、作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。1971年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称。一、基本概念1.固定化酶：固定在载体上，并在一定空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。（分离提纯的酶）2.固定化菌体：固定于载体上的菌体或菌体碎片，称为固定化菌体，它是固定化酶的一种形式。（菌体即死细胞或细胞碎片上的酶或酶系）①物理吸附法通过载体表面和酶分子表面之间的氢键、疏水键和π-电子亲和力等物理作用力，将酶固定于不溶性载体（固体吸附剂）的方法，称为物理吸附法，简称吸附法。1、吸附法（1）原理常用吸附剂：a.无机吸附剂：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微

4、孔玻璃、羟基磷灰石，活性炭等。无机吸附剂的吸附容量一般很低，多在1mg蛋白/g吸附剂。b.有机吸附剂：纤维素、胶原、火棉胶等。有机吸附剂的吸附容量一般较高，如火棉胶膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸酯酶等，吸附容量为70mg蛋白/cm2膜。是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如AmberliteXE-97、DoweX-50等。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。②离子交换吸附法DEAE—

5、纤维素吸附的α—淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶（2）制备方法：a.静态法：在没有搅拌、振摇的情况下，将载体直接加入酶溶液，通过自然吸附、解吸、再吸附等过程、制备固定化酶。该法操作简便，但效率低，耗时，吸附量小且不均匀。b.电沉积法：在酶溶液中放置两个电极，在电极邻近加入载体，接通电源，酶移向电极并沉积到载体表面，以制备固定化酶。该法可提高吸附时局部浓度，增加吸附量，但要注意酶在电场中的稳定性。c.混和振摇装载法：是实验室常用方法，载体与酶液混和后，要在搅拌下或摇床连续振摇下完成固定化。该法固定化较为均匀，要注意搅拌或振摇速率，既不破坏酶和载体结构，又要达到

6、充分混和目的。d.反应器装载法：这是工业上常用方法，它将固定化和其后的应用连在一起，即先将载体装于反应器中，再加上酶液，然后通过循环流振动方式使酶和载体达到充分混和。①pH：影响载体和酶的电荷变化，从而影响酶吸附。②离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。③蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。④温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。⑤吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。⑥载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。（3）影响酶蛋白在载体上吸附程

7、度的因素:（4）吸附法的优点、缺点吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。世界第一例获得工业应用的固定化酶是DEAE-SephadexA-25吸附的氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析。(1)基本概念：将酶或含酶菌体包埋于各种多孔载体中，使酶固定化的方法，称为包埋法。(2)包埋常用载体：琼脂、聚丙烯酰胺、海藻酸钠、琼脂糖、角叉菜胶等。(3)包埋法的类型：主要有胶格包埋、微囊型包埋、脂质体包埋

8、。2、包埋法a.胶格包埋或称凝胶包埋：①常用凝胶：天