WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性研究.doc

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1、WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性研究：胡绍燕，陈子兴，赵晔，岑建农，谷敏，傅铮铮，何军，顾伟英【摘要】本研究探讨CF7、T47D、293株细胞和MC7721、HT29、SHG44细胞株；利用流式细胞术检测转基因细胞稳定表达EGFP的平均荧光强度。以平均荧光强度代表启动子和（或）增强子的转录活性。结果表明：通过基因重组技术构建了含有CF7和SHG44细胞次之，分别为9.46±1.10和7.29±0.73倍，HT29细胞表达最低，仅为0.99±0.02倍。在人类血病细胞株中，K562细胞EGFP的平均荧光强度最高，是空载体pEGFP1的2.93±0

2、.27倍，明显高于Jurkat和SHI1细胞株（p＜0.05）。后二者分别为0.74±0.03和0.84±0.09倍。pECF7,T47Dand293)andMC7721,HT29andSHG44).Themeanfluorescenceintensity(MFI)ofEGFPrepresentingthetranscriptionalactivitiesofpromoterand/orenhanceretryinthetransfectedcellsoterandpECF7andSHG44(9.46±1.10and7.29±0.73timesofpEGFP1

3、level),andloesasmuchaspEGFP1)respectively.Amonghematopoieticcelllines,EGFPexpressionesofpEGFP1),esofpEGFP1level)respectively.pEBI公司产品；AflⅡ和StuⅠ为TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司产品；小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）为Promega公司产品；Klenoa公司产品；脂质体为Invitrogen公司产品；EpicsXL型流式细胞仪为Coulter公司生产；实时定量PCR试剂购于TaKaRa公司。实时定量PCR仪MJResear

4、chOpticon2TM为MJ公司产品；BDFACSAriaTM为BectonDickinson公司产品，用于细胞分选。重组载体构建CF7，T47D，人类结肠腺癌细胞株HT29，人类肝癌细胞株SMMC7721，人神经胶质瘤细胞株SHG44，人脐静脉内皮细胞转化细胞株ECV304，人类胚胎肾转化细胞株293细胞株均为本室保存，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。含15%胎牛血清（FCS）（杭州四季青公司产品）的RPMI1640（Gibco/BRL产品）完全培养液用于NB4、K562、U937、THP1、Jurkat、SHG44、ECV304、293、SMMC

5、7721、MCF7、T47D细胞的常规培养，SHI1细胞株培养于含15%胎牛血清的IMDM（Gibco/BRL）完全培养液中，HT29培养于含10%胎牛血清的Moca5A（Gibco/BRL）完全培养液中。细胞转染①电穿孔转染目的基因：取对数生长期的NB4、U937、SHI1、THP1与Jurkat细胞1×107，将细胞悬液与20μg质粒DNA（分别是pEGFP1、pECF7、T47D、ECV304、SMMC7721、SHG44、HT29和293细胞。转染48小时后，1∶10传代并用合适剂量的G418筛选。绿色荧光蛋白平均荧光强度的检测收集2×106细胞

6、，用1×PBS洗涤2次，加入完全培养液1ml，在Coulter公司EpicsXL型流式细胞仪上检测绿色荧光蛋白的平均荧光强度。上机检测前，再用1×PBS洗涤2次。激发波长为488nm，释放波长为507nm。EGFP基因转移效率的鉴定稳定转染pE的分析软件在BDFACSAriaTM流式细胞仪上对K562/pEJResearchOpticon2TM荧光定量PCR仪上检测EGFP拷贝数，并以β2MG基因的拷贝数进行标化。优化的EGFP的检测体系为：5×PCR缓冲液5.0μl，250mmol/LMgCl20.6μl，10mmol/LdNTPs0.75μl，20×SYBRGre

7、enI1μl，12.5μmol/L引物各0.5μl，5U/μlHSTaqDNA聚合酶0.25μl，DNA1μl(相当于50ng的基因组DNA)，反应总体积为25μl。反应条件为：94℃5分钟；94℃45秒；63℃1分钟,38个循环，分别于78℃和85℃时采集荧光信号。EGFP的引物序列：E1:5'CACCATGGTGAGCAAGGGCG3'，E2:5'CTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTC3'，产物730bp。基因组DNAβ2MG基因的序列：正义链:5'CAGGTTTACTCACGTCATCCAGC3'，反义链:5