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1、高效利用磷酸钙和卵磷脂功能的细菌菌株筛选 溶磷菌在转化土壤难溶磷、提高磷肥利用率、促进作物生长方面都具有显着作用,而不同溶磷菌对不同形态难溶磷的溶解能力存在差异。溶解难溶性磷酸盐的细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、节杆菌(Arthrobacter)、沙雷氏菌(Serratia)、肠杆菌(Enterobacter)和伯克霍尔德氏菌(Burkholde-ria)等,溶磷量最高可达643.2mg/L;而溶解有机磷的细菌主要有芽孢杆菌(Ba
2、cillus),溶磷量达到26.5mg/L。 溶磷菌溶磷机制各不相同,大部分溶磷菌以分泌物溶磷,其胞外分泌物中含有多种溶磷物质,近年来的研究主要集中在有机酸和磷酸酶方面。研究表明,大部分溶磷微生物的胞外分泌物中含有大量有机酸,所以一致认为有机酸是主要的溶磷物质;另外微生物生长繁殖过程中,分泌出酸性磷酸酶和碱性磷酸酶,这些磷酸酶能够不断地将环境中的有机磷转化为无机磷。蛋白质、多糖、氨基酸等物质在环境中可能会溶解难溶磷,这些物质可能也与溶磷菌的溶磷效果有关,但目前此方面研究较少。为此,本研究从生活垃圾堆积地采集土
3、样,筛选兼具高效利用磷酸钙和卵磷脂功能的细菌菌株,并测定其在不同磷源培养下胞外分泌物中的有机酸、蛋白质、多糖、氨基酸含量及酸性磷酸酶活性,以期为高效溶磷菌的筛选及其溶磷机制研究奠定基础。 1材料和方法 1.1土样 供试土样取自生活垃圾堆积地非根际土壤。 1.2难溶磷培养基 葡萄糖10.0g、(NH4)2SO40.5g、NaCl0.3g、KCl0.3g、MgSO47H2O0.3g、FeSO47H2O0.03g、MnSO41.0g、Ca3(PO4)25.0g或卵磷脂2.0g、无菌水1L,pH值7.0~7.
4、5。 1.3溶磷菌的筛选和溶磷能力的测定 将采集的土样用稀释平板法涂布于难溶磷卵磷脂培养基上,30℃培养5d,挑选周围产生明显透明圈的单菌落划线纯化后保存于LB固体斜面培养基上。用灭过菌的牙签将筛选出的菌株分别点接在2种难溶磷固体培养基上,30℃培养5d,挑选在2种难溶磷固体平板上均能产生明显透明圈的单菌落,并测量溶磷圈直径(D)和菌落直径(d)。挑选D/d或D值较大的菌株,按1%接种量分别接入2种难溶磷液体培养基中,摇床培养6d(30℃、150r/min)。发酵液经10000r/min离心10min,用钼
5、锑抗比色法测定上清中可溶性磷含量,选择溶磷量最大的菌株进行鉴定。 1.4溶磷菌的鉴定 1.4.1生理生化鉴定参照文献[12]对溶磷菌分别进行生长温度试验、接触酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、糖醇类发酵试验、厌氧生长试验。 1.4.216SrDNA分析采用DNA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取细菌基因组DNA,利用16SrDNA通用引物(P1:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;P2:5&prim
6、e;-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR反应条件:95℃5min;30个循环(94℃1min,55℃1min,72℃2min);72℃10min。扩增产物经PCR产物纯化试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司)回收,连接pSURE-T载体后测序。 利用Blast将测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行比对分析,采用Mega5.05软件以邻接(Neighbor-Joining)法构建系统发育树。 1.5溶磷菌胞外分泌物中溶磷物质含量及活性测定将活化好的菌
7、株按1%接种量分别接种于以磷酸钙、卵磷脂、磷酸氢二钾(对照)为唯一磷源的液体培养基中,30℃振荡培养,分别于第2、4、6天取培养液以8000r/min离心10min,每个处理设3个重复。分别利用酸碱滴定法、茚三酮显色法、蒽酮法、DNS法及考马斯亮蓝G250染色法测定上清液中的有机酸、氨基酸、总糖、单糖及蛋白质含量,利用对硝基苯磷酸二钠法测定上清液中酸性磷酸酶的活性。 2结果与分析 2.1溶磷菌株的分离、筛选初筛出32个可以溶解卵磷脂的菌株。将这些菌株点接于2种难溶磷固体平板上,有10株菌株在平板上形成明显透
8、明圈,说明这10株菌株都具有降解卵磷脂和磷酸钙的能力。其中,菌株LY4、LY8、LY12、LY25在卵磷脂培养基上的D/d值较大,均大于3.0;LY7、LY8、LY10、LY25在磷酸钙培养基上的D/d值较大,均大于2.0。 2.2溶磷菌溶磷能力分析综合考虑D、D/d值,挑选菌株LY4、LY7、LY8、LY10、LY12、L25进行液体摇瓶复筛试验,以确定不同菌株对不同难溶磷源的溶解
