高丽参水溶性多糖GPⅢ的分离纯化及组成研究.doc

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1、高丽参水溶性多糖GPⅢ的分离纯化及组成研究【摘要】目的：从高丽参中提取出水溶性粗多糖GP，经分离纯化，得到均一多糖GPⅢ，研究其组成等性质。方法:粗多糖经Sevage法脱蛋白，DEAESepharoseCL6B柱层析分离纯化得到GPⅢ，经HPLC和醋酸纤维素薄膜电泳法检验其均一性。结果：GPⅢ是均一组分多糖，GC分析它的单糖组成是葡萄糖。结论：GPⅢ是均一组分多糖，GC分析单糖组成是葡萄糖，方法准确。【关键词】高丽参分离纯化组成　　高丽参为五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey的干燥根。主产于我国东北地区,朝鲜和日本，俗称别直参［1］。本文对高丽参粗多糖进行分离纯化，并对它的

2、组成成分等性质进行了研究。　　1材料、试剂与仪器　　1.1材料高丽参:购于辽宁丹东。　　1.2试剂与仪器单糖标准品为Sigma公司试剂；DEAEsepharoseCL6B凝胶为Pharmacia公司产品；其他试剂均为上海化学试剂有限公司分析纯。MC992自动核酸蛋白分离层析仪，上海沪西分析仪器厂；高效液相色谱，安捷伦HP1100；气相色谱仪，安捷伦6890N。　　2实验方法　　2.1高丽参粗多糖的提取准确称取高丽参250g，加入一定体积80%乙醇，在50℃水浴中回流提取6h，离心得提取液。残渣烘干后，取50g加入3000mL的蒸馏水，在80℃恒温水浴下提取2h，过滤，滤液在60℃下减压

3、旋转蒸发浓缩，离心，上清液加入4倍体积无水乙醇进行醇沉，放置4℃冰箱中过夜。次日离心10min(3000r/min)，取沉淀，常规干燥得粗多糖GP。　　2.2粗多糖的分离与纯化［23］　　2.2.1脱蛋白3%糖溶液，按木瓜蛋白酶：蛋白质1：50取蛋白酶，加入糖溶液中，将糖液装入透析袋，37℃，保温24h，加少量二甲苯防腐。按糖液总体积1/4加入Sevage试剂(氯仿:正丁醇＝4:1)，充分振荡2～3h，静止，离心，取上清重复，至无游离蛋白为止。　　2.2.2粗多糖的DEAESepharoseCL6B柱层析制备500mg经脱蛋白后得GP溶于10mL蒸馏水,先后用蒸馏水和01MNaCl

4、进行洗脱，流速调为40mL/h，1管/12min，自动部分收集器收集。用苯酚3硫酸法测定糖的分布情况，按各个波峰范围部分收集洗脱液，由分离层析仪中的UV160A紫外光谱于280nm下同步检测蛋白质。　　2.3多糖样品纯度鉴定方法［4］多糖样品的纯度鉴定采用高效液相色谱法和醋酸纤维素薄膜电泳法。高效液相色谱柱为SUGARKS804，水作流动相，流速1mL/min，柱温50℃，示差检测器检测。　　2.4红外光谱分析取2mg糖样，KBr亚片，红外光谱分析。　　2.5糖组成分析［46］10mg的糖样溶于10mL2M三氟乙酸120℃水解6h，水解产物用无水乙醇蒸除三氟乙酸至中性，干燥产物进行衍

5、生物的制备(硅烷化)。气相色谱柱是HP5毛细管柱(30m×0.32mm,0.25μm)，柱温采用程序升温即160℃20℃/min180℃10℃/min220℃(2min)，检测器和进样口温度均是230℃。　　2.6分子量测定［4］取标准样品(T10、T40、T70、T500、蓝色葡聚糖、葡萄糖)及待测样品溶于去离子水中，用0.4μ纤维素膜过滤，进样，测出各自的保留时间。根据各标准品的保留时间,按公式Kav(VeVo)/(VtVo)求出对应的Kav,以LogMw对Kav作图得标准曲线。同样测出样品的保留时间,求出其Kav从标准曲线上即可求出其分子量。　　3结果与分析　　3.1粗

6、多糖的提取与分离纯化高丽参经水提取,粗多糖GP得率为28.05%。GP经脱蛋白后，上DEAESepharoseCL6B柱层析制备，按01MNaCl制定洗脱曲线，GP的NaCl梯度洗脱液经苯酚硫酸检测只含有一个糖洗脱峰，紫外检测仪在280nm下也检测到1个蛋白质洗脱峰，并且与糖洗脱曲线相吻合，推测此糖组分可能含有结合蛋白质，收集42～60管洗脱液，透析，浓缩，醇沉，沉淀常规干燥命名为GPⅢ。　　3.2GPⅢ的纯度鉴定配制0.1%的样品液，0.4μ纤维素膜过滤，进样量20μL。GPⅢ的高效液相色谱结果检测出一条峰，证明GPⅢ是纯度较好的样品。GPⅢ在醋酸纤维素薄膜电泳上也跑出来一条区带，

7、再次验证GPⅢ为成分单一的一种多糖。　　3.3GPⅢ的分子量鉴定GPⅢ的保留时间分别是6.085,查标准曲线，得GPⅢ的分子量分别在40万左右。　　3.4GPⅢ的性质分析红外光谱分析表明，GPⅢ在3600～3200cm有OH吸收峰,在2923cm左右有一强吸收峰,为CH、CH2共振吸收峰,在1635cm左右有多糖的水合振动峰。GPⅢ经酸水解，衍生化后的气相色谱结果(图略)，对照标准单糖的气相色谱图，中间