精液冷冻概述课件

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1、精液冷冻技术概述四川大学华西第二医院人类精子库2精液冷冻历史回顾1776年Spallanzani偶然发现将人精液埋藏于冰雪仍可存活1886年Mantegazza发现在－15℃下的精子可以存活较长时间；1937年Jannel报告人类精子可在-196℃中存活；1949年Polge首先发现甘油对冷冻精子具有特殊保护作用。3冷冻精液的临床意义供者人工授精（AID）使用方便，并且可以配合女性生殖周期进行；对有先天遗传疾病和严重传染性疾病的患者可以使用；进行生殖保险；如男性绝育手术者，肿瘤患者化疗前，从事危险行业者等；对于少、弱精症者，可多次采集冷冻后加以浓缩；对于取精困难和梗阻性无精症的患者在ICSI

2、治疗时，用冻融精子代替新鲜精子可避免反复抽吸睾丸或附睾，利于医患双方掌握治疗进度。4冷冻损伤原理冰晶损伤学说icecrystaldamage溶液效应学说solutedamage5冷冻原理降温过程分期：温度休克期RT~5℃潜热扩散期5～0℃冰晶形成期0～－15℃再结晶期－15～－79℃保存期－80～－196℃6冷冻损伤原理精子示意图：精子细胞外冰晶形成胞内冰晶形成细胞脱水冰晶损伤溶液损伤降温快速慢速7冷冻对精子产生的损伤超微结构的损伤：冷冻复温后的精子外膜变薄，波浪状改变或破损，胞浆、顶体内和线粒体内透光度增加，顶体增宽，线粒体外形变圆，轴丝增粗，提示细胞肿胀是形态改变得主要征象。精子功能：日

3、本学者研究根据精子顶体功能和穿透率无显著变化，发现冷冻精子授精能力无下降。染色体：目前对冷冻保存精子染色体自然畸变率报道不多，仍存在争论8冷冻保护原理冷冻保护液渗透性增加细胞内外的渗透压，降低细胞内外液的冰点，减少冰晶的形成。非渗透性调节PH，细胞外渗透压，增加营养不同温区最适的冷冻速率研究表明过快或过慢的降温都是不合适的，应根据不同的冷冻保护剂选择各个温区最佳的降温速度。目前还未找到。9冷冻保护剂（CPM）根据CPM的特性：非渗透性CPM：卵黄、葡萄糖、蔗糖渗透性CPM：甘油根据CPM种类:单一甘油型复合甘油型无甘油型10冷冻保护剂（CPM）各成分的主要作用:甘油：有渗透性，当进入精子细胞

4、内时使精子内的含水蛋白质稳定，降低细胞内液冰点，减少冷冻时细胞内冰晶的形成。但甘油本身对细胞也有一定的毒性，一般终浓度控制在7～10％。卵黄：提高细胞外渗透压，含有卵磷脂，可以稳定精子的细胞膜，防止顶体外膜破裂。它的缺点是冻融后有大量的颗粒和碎片，并且有病毒感染和过敏反应当可能。11冷冻保护剂（CPM）各成分的主要作用:葡萄糖：与调节渗透压有关缓冲系统：可以结合游离的H+和OH－，有助于溶液和精子脱水现在常用CPM:单一甘油型G－Y－C型（甘油－卵黄－柠檬酸钠型）TEST－G－Y－C（TES－Tris缓冲系统＋GYC）型G－Y－C－G型（GYC＋谷氨酰胺）改良T－G型（改良Tyrode液－甘

5、油型）12冷冻保护剂（CPM）改良T－G型，它的优点有：相比有较好的冷冻复苏率（本精子库平均62.6％）可准确配制不含卵黄，消除可能的病毒感染和过敏反应背景清晰，无大量颗粒和碎片储存时间长，可达3个月13降温程序分类：程序降温：利用程序降温仪进行精确降温。手工降温：利用现有降温设备和液氮蒸气分步骤降温。注：由于现在还没有找到降温过程中各个温区最佳降温速率，文献报道的各种降温程序精液复苏率效果不一！降温前处理：在室温中将精液与CPM1:1混匀，通常是在20min逐量加入，且用振荡器持续振荡，转速约300/min。此过程在提高精液复苏率中起重要作用之一。14降温程序程序降温得到多数学者的认同，有

6、精确定降温速率控制，复苏率较高。缺点是仪器昂贵，使用和维护费用也较高，不适合普及。15降温程序手工降温：25℃（RT下加CPM）—4℃-20min—LV（LN上5cm处）-10min—LN25℃（RT下加CPM）—4℃-60min—－20℃-20min—LN25℃（RT下加CPM）—4℃-20min—－20℃-20min—LV（LN上5cm处）-5min—LN25℃（RT下加CPM）—LV（LN上5cm处）-15min—LN16复温程序原则：是快冻快复、慢冻慢复方法：37℃水浴快速复温复温损伤机制：Mohammad等连续观察精子在冷冻过程中的损伤情况发现绝大多数的细胞损伤发生在复苏期。当快速

7、降温时使细胞内产生小冰晶，如果缓慢复温，小冰晶将会融合成大冰晶对细胞形成损伤；当慢速降温时细胞外的水分首先结冰，胞外溶质浓度升高导致精子细胞脱水，快速复温使胞外的水分来不及回渗，造成精子的皱缩，形成溶质性损伤。17冷冻复温后的处理使用精子营养液可使复温后的精子在较长时间内保持良好的活动率。使用化学物质如：己酮可可碱（PF）、2-脱氧腺苷（2-DA）提高冷冻复苏后的精子的活率和活力。18精液研究的新进展玻璃化低