农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法

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1、农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法制备转化用的农杆菌菌液准备：1．灭菌试管400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。2．试剂：YEP1200ml（每瓶300ml共4瓶）+Kan1;1000，Rif1:500。1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。3．步骤：共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约1

2、4小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g离心10min。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600约为0.8--1.0左右即，用10%蔗糖作对照。转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。（注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）

3、。2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。4．转化过程略，视苗的长势弱0.8Pa3`，长势好的0.8Pa5`。5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥（2）拟南芥种植取Columbia生态型的拟南芥种子，在EP管中用70%的酒精消毒2-3min，10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1%的Topagar混匀

4、，平铺在1/2MS培养基上，4℃保湿黑暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000Lux、18℃、RH为70%条件下培养。一周后，选择生长健壮的幼苗移栽到培养土中。每周浇一次1/2PNS培养液。当幼苗长至3-4cm时，去除花序，在去除顶端花序四天后进行转化。转化前将已经开花授粉的花和种子去除干净。（3）抽滤法转化拟南芥及阳性苗筛选1活化农杆菌；2、以1:50比例转接到200mlLB培养基中，28℃，2000rpm培养至OD600=1.2-1.6;3、4000rpm，离心15min，收集菌体；4、重悬于渗透缓

5、冲液(1/2MS培养基+5%蔗糖配置后在121℃灭菌20min，加终浓度0.02-0.03%SilwettL-77，振荡混匀)，以重悬渗透液为对照，调节OD600=0.8-1.0；5、将已授粉、结荚的拟南芥用消毒剪去除，倒置于装有渗透缓冲液的合适大小的容器上侵染50S，用塑料薄膜覆盖整个托盘并适留通气孔后，在弱光下培养，24h后取下薄膜，于室温中继续培养。6、约30日后收获种子，将收获的转基因种子用含有0.2%的TritonX-100浸泡10min；7、用10%的次氯酸南表面消毒10-12min；8、灭菌水冲洗5-6次，每次约2min；9

6、、用水将转基因种子置于含50mg/LKan的MS平板上，4℃暗培养两天；20mg/LHyg潮霉素筛选连续暗培养7天；10、Kan抗性筛选的种子在22℃，16h光照/8h黑夜光周期培养。两周后，经Kan抗性筛选的阳性植物表现良好，长势正常，而阴性植物则不萌发或不久死亡。1拟南芥的种植试剂配制人工土：3份蛭石，1份珍珠岩和1份黑土混合PNS营养液：每升含5ml1MKNO3，2ml1MCa(NO3)2˙4H2O，2ml1MMgSO4˙7H2O，2.5ml20mMFe.EDTA，2.5ml1M磷酸缓冲液（pH5.5），1mlMS微量元素。PNS营

7、养液母液配方①1MKNO3101.1g②1MCa(NO3)2˙4H2O236.15g③1MMgSO4˙7H2O，246.48g④20mMFe.EDTA：FeSO45.57gEDTA7.45g注意先各自配成溶液，在混合。⑤1M磷酸缓冲液（pH5.5）：磷酸二氢钾130.4g磷酸氢二钾9.12g⑥MS微量元素硼酸0.434g硫酸锰（MnSO4H2O）1.7626gCuSO4˙H2O0.0798gZnSO4˙7H2O0.172gNaMoO4˙2H2O0.0432gNaCl0.585gCoCl˙6H2O0.00129g以上母液均配至1L种植步骤将

8、春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，并用保鲜膜罩上。两天后光照，三天后揭膜。人工培养室条件：相对湿度80%，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周