重组人表皮生长因子复方抗菌凝胶生物活性检测方法的建立

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1、重组人表皮生长因子复方抗菌凝胶生物活性检测方法的建立首席医学网    2006年05月25日【关键词】磺胺嘧啶银摘要:目的与方法通过探讨用MTT法检测重组人表皮生长因子（rhEGF）复方抗菌凝胶生物活性的试验参数，包括凝胶剂中卡波姆含量对测定的屏蔽作用、不同试剂对卡波姆组分屏蔽作用的解除、抗菌成分磺胺嘧啶银浓度以及EGF含量对复方凝胶检测方法的影响作用等，建立一套适合用于EGF复方抗菌凝胶剂生物活性的检测方法。结果优选出的最佳条件：EGF质量分数为20μg/g，卡波姆质量分数为1.0%，用尿素+PBS+甘氨酸作屏蔽剂，磺胺嘧啶分数浓度为0.5%~2.0%。结

2、论 本文方法可快速准确地对EGF复方凝胶活性进行检测,从而为复方凝胶剂的开发提供条件。关键词:重组人表皮生长因子;磺胺嘧啶银;复方;凝胶剂MTT法表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)可明显促进创面愈合，尤其对一些难愈合创面作用更佳，具有很高的临床价值［1-6］。目前临床上主要使用基因工程生产的重组人表皮生长因子（recombinanthumanEGF,rhEGF）凝胶剂［7］。古巴的rhEGF凝胶与磺胺嘧啶银的复方制剂已经上市，国内也有数家单位正处于研发阶段［8,9］。在开发rhEGF复方抗菌凝胶的过程中，最大的困难在于rhEG

3、F复方抗菌凝胶的生物活性检测问题。本文通过改良MTT［10］结合酶联仪的检测方法，对rhEGF复方抗菌凝胶几个组分浓度进行分析，拟建立了一套简便有效的检测方法。　1 材料和方法1．1细胞株　Balb/c3T3，由中国药品生物制品检定所提供。1．2 培养基RMIP1640，购自GIBCO公司；1．3 试剂四甲基偶氮唑盐(MTT),购自JANSSENHIMICA公司；小牛血清(calfserum，CS)，购自Hyclone公司；EDTA、NaCl、磷酸盐生理盐水缓冲液(PBS)、尿素、甘氨酸（上海生工公司），分析纯。1．4 仪器振荡器，购自德国IKA公司；酶标仪

4、，BIOTEK公司。1．5 样品EGF国家标准品：由中国药品生物制品检定所提供，－20℃保存。rhEGF复方凝胶样品［9］：自制，主要成分为rhEGF、磺胺嘧啶银、卡波姆，通过设定不同质量分数的卡波姆组分，测定其活性最佳的配方。对照品：rhEGF水溶液，由桂林华诺威公司提供，用超纯水稀释成ρ=1mg/mL的EGF溶液，待用。1．6细胞培养将保存在液氮的Balb/c3T3细胞用含ρ=20％CS的RMIP1640复苏培养再活化，然后用含ρ=10％CS的RMIP1640培养基培养，传代1次，待铺展率达到70％~80％后用于检测。1．7 rhEGF复方抗菌凝胶优化B

5、alb/c3T3细胞增殖MTT检测法 准确称取rhEGF复方抗菌凝胶1.0g，加入200 mL含ρ=0.4%CS的RMIP1640培养基中，在混合器上振荡1min，然后用0.22 μm的滤膜过滤，得到澄清滤液。以此滤液作为第一个稀释度（40），然后继续进行4倍稀释，至4-5，将各个稀释度样品加在已接种Balb3T3细胞的96孔板中，培养72h，用MTT法于490nm波长处检测活性。标准品的第一个稀释度（40）为50IU/mL，同样4倍稀释至4-5。用同等浓度的水剂做对照；含ρ=10%CS的RMIP1640培养基做阳性对照；含ρ=0.4%CS的RMIP1640

6、培养基做阴性对照。1．8 卡波姆干扰作用屏蔽剂的加入将不同试剂分别与样品作用，旋涡10min震荡分散，再加入甘氨酸，混匀，过滤，取滤液。1．9 评估公式样品效价（IU/mg）=50IU×200×标准品半效价量稀释度    样品相当于标准品半效价量稀释度――50IU为标准品的第一个稀释度活性；――200为样品预稀释度2结果与讨论2.1rhEGF凝胶中卡波姆组分对表皮生长因子生物活性测定的影响　以卡波姆为变量，分别配制几种不同质量分数卡波姆的EGF（20μg/g）凝胶。凝胶外观为水溶性无色透明、质地均匀的凝胶制剂。随着卡波姆浓度的提高，凝胶剂的黏度相应提高。样品

7、处理参照“1.7”。根据对不同浓度卡波姆凝胶剂的生物活性测定，发现卡波姆成分在测定中，对细胞生长具有一定的抑制作用。随着卡波姆浓度的提高，其测出的生物活性与同浓度水剂对照品具有较大的差异，见图1。结果表明，ω=0.5%、1.0%的卡波姆对EGF生物活性无显著影响，ω=2%、3%的卡波姆对EGF生物活性影响较大，综合考虑凝胶剂的铺展性和黏度，优选了卡波姆终质量分数为1.0%的凝胶作为备选浓度。2．2不同试剂对EGF复方抗菌凝胶屏蔽作用的解除配制磺胺嘧啶银质量分数1.0%、EGF20μg/g的凝胶，用纯水+甘氨酸、EDTA+甘氨酸、PBS+甘氨酸、尿素+PBS+

8、甘氨酸处理样品，取滤液检测生物活性。实验结果显示，复