肠道病毒感染病例标本的处理细胞接种和观察PPT课件

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1、肠道病毒感染病例标本的处理、细胞接种和观察1人肠道病毒简介和分类•小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的成员，主要在肠道内复制,但可感染各个系统和器官。•单正链的无包膜RNA病毒，RNA有感染性。•小球形病毒（~30nm），20面体对称结构。•衣壳有VP1-VP4四种蛋白，VP1-VP3分布在表面，VP4与内部RNA结合。•与鼻病毒不同的是，它们在酸性环境中稳定。•在胞浆增殖，有明显CPE，破胞释放。•引起多种疾病：麻痹性疾病、无菌性脑膜炎、心肌损伤、手足口病，结膜炎，皮疹等。2电镜下的病

2、毒形态34病毒特性肠道病毒适合在湿、热的环境下生存与传播，对乙醚、去氯胆酸盐等不敏感，75%酒精和5%来苏亦不能将其灭活，但对紫外线及干燥敏感。各种氧化剂(高锰酸钾、漂白粉等)、甲醛、碘酒都能灭活病毒。病毒在50℃可被迅速灭活，但1mol浓度二价阳离子环境可提高病毒对热灭活的抵抗力，病毒在4℃可存活1年，在-20℃可长期保存，在外环境中病毒可长期存活。5人肠道病毒传播方式>粪-口途径传播:唾液与粪便>呼吸道传播:空气飞沫>接触传播:一般人肠道病毒在呼吸道飞沫中可存留约一至三周，而经胃肠道的粪便排泄可达

3、到二至三个月以上。6病毒的组织培养所有已知的人肠道病毒都可以在组织细胞培养或乳鼠中繁殖；大部分血清型可以在1种以上的人源传代细胞中生长；但是没有哪一种细胞可以支持所有的人肠道病毒生长；研究至今，一些血清型（如CoxA1病毒）只能在乳鼠中繁殖。7实验室检测方法临床怀疑：夏秋季，婴幼儿、皮疹、接触、脑膜炎实验室的检测方法包括：1)血清抗体的变化：血清抗体4倍变化2)病毒培养及鉴定：理想（金标准）但费时费力，且部分肠病毒型别不易培养3)组织病理切片检查4)分子生物学检测，RT-PCR，RealTimePCR

4、，分子杂交等5)快速抗原检测：芯片8病毒分离–诊断肠道病毒感染的最主要手段，也是金标准。–柯萨奇B组病毒和埃可病毒可以很容易地在细胞培养上生长。适合的标本有咽拭子、粪便标本，鼻拭子等，也可以从脑脊液中分离到病毒。–一些柯萨奇A组病毒不容易通过细胞培养进行分离，可以通过乳鼠进行分离，但是操作比较复杂，一般实验室不常规使用这种方法。分子生物学的方法更适合这种病毒的诊断。•血清学方法–自从细胞培养已经可以用做病毒分离后，血清学方法已经不经常使用了。–中和实验，但是非常繁琐，因此，一般也不做这方面的实验。9细

5、胞培养分离方法•1990年以前，大都都采用Vero、GMK细胞分离；•1994年以后，人结肠癌上皮细胞（Caco-2）取代了Vero细胞；•1998年人们开始用人肺系细胞（MRC-5）分离CoxA16等毒株，其敏感性与Caco-2细胞相当。•目前，大都使用人源细胞如人喉癌上皮细胞（HEp-2）、人横纹肌肉瘤细胞（RD）用于病毒分离。RD细胞支持大多数柯萨奇A组病毒复制。•对一些不能在细胞上生长的病毒，可用乳鼠接种分离病毒。但埃可病毒一般不引起乳鼠发病。10标本的采集（一）粪便标本：采集病人发病7日内的

6、粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5~8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。（二）咽拭子标本：采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3~5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长

7、期保存的标本存于－70℃冰箱。（三）血清标本：采集急性期（发病0~3d）和恢复期（发病14~30d）双份配对血清用于抗体检测。静脉采集3~5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于－20℃以下冰箱中冷冻保存。11（四）疱疹液：在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒具有很高的诊断价值，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3~5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管

8、中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。（五）脑脊液标本：出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测，从脑脊液中分离病毒也具有很高的诊断价值。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0~2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70