俞萍闫小毅肌营养不良症dmd基因检测课件_1

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1、实验四进行性肌营养不良症（DMD）基因检测进行性肌营养不良症(Duchennemusculardystrophy，DMD)是肌肉组织的遗传病，特点是进行性加重的肌肉萎缩和无力。本病呈X连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。GeneticsofDMDOMIM#310200occurringinabout1in3500males,X-linkedrecessive,lethalinmales,1/3ofpatientsarenewmutants;2/3havecarriermothers,Genelocati

2、onXp21,largegene(morethan2000kb),79exons.Highmutationrate,60%to65%ofthemutationsaredeletions,andabout6%areduplications,Allelicmutationsinthesamegenecauseamilderdisorder,Beckermusculardystrophy.DuchenneMuscularDystrophy,DMDDMD基因定位于Xq21.2-21.3之间，79个外显子组成

3、，编码3685个氨基酸、分子量为427kD的蛋白质一抗肌营养不良蛋白(dystrophin)，这种蛋白具有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。抗肌营养不良蛋白的编码基因有多种突变形式，60％是外显子缺失突变，通常选择DMD基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的90%。本实验设计为扩增DMD基因中4个外显子，其中外显子45和48在中国患者中的检出率分别为26%和48%。DMD基因4个外显子的引物顺序见表：外显子PCR产物大小引物F引物R8360gtcctttacacactttacctgttga

4、gggcctcattctcatgttctaattag19459ttctaccacatcccattttcttccagatggcaaaagtgttgagaaaaagtc45547aaacatggaacatccttgtggggaccattcctattagatctgtcgccctac48506ttgaatacattggttaaatcccaacatgcctgaataaagtcttccttaccacac聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）是一种体外由引物介导的特定DNA序列的酶

5、扩增方法，由于此方法对样本要求的微量性以及它特异、敏感、高速的特性，近年来得到广泛应用。全过程是基于一套“三步曲”的若干轮次的循环组合而成的。依次为DNA模板热变性，双链DNA解链成单链；在低温下与引物退火，引物与单链DNA互补配对；在适宜温度下TaqDNA聚合酶催化引物延伸。以上三步为一个循环，循环25-35次，模板DNA可扩增100万倍左右，整个反应可在2到3小时内完成。PCR操作如下：每一个薄壁离心管中加入试剂的量为：（反应总体积为25l）：双蒸水17.8l10XBuffer2.5lMg

6、Cl22ldNTPs0.5lPrimerR+F(混合)1.4lDNA模板0.5lTaq-DNA聚合酶0.3l石蜡油1滴放置在PCR循环仪上，循环参数设置为：Step1(1个循环)94C5分钟Step2(30个循环)94C30秒56C30秒72C30秒Step3(1个循环)72C7分钟琼脂糖凝胶电泳(agarosegelelectrophoresis):①配制2%的琼脂糖凝胶配制1×TBE电泳缓冲液70ml于三角烧瓶中，称取1.4克的琼脂糖粉放入后，微波炉加热熔化,冷却至60℃，加

7、入溴乙锭(EB)，倒入电泳槽中，插入梳子，待凝固。②向电泳槽中倒入1×TBE，没过胶面2mm，小心移去梳子。③取PCR扩增样品15l加入3l的6×载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。④接通电源，一般红色为正，极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。140V，电泳2小时左右。⑤卸下凝胶，于紫外仪上观察电泳条带，并与核酸分子量标准PUC19/MspⅠ(marker)比较。10lPCR产物混匀加样电泳(140V,2hr)紫外灯下观察2l6*loadingbuffer注意

8、事项：1、引物设计时长度15～30个碱基为宜，G+C含量一般为40%～60%。2、退火温度决定PCR反应的特异性，退火温度高PCR反应的特异性好；温度低，有时会有非特异性条带。3、Mg2+浓度对扩增产物的特异性及产量有显著影响，Mg2+浓度低，扩增产物的特异性好，但有时产量低；Mg2+浓度高，扩增产物的特异性差，有非特异性条带。4、PCR循环的次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上25-30次循环后，PCR产物积累即可达到最大值。在满足产物得率的前提下，应尽量减少循环