流式细胞术分析血液淋巴细胞免疫表型方法学研究

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1、中华检验医学杂志2000年第23卷第4期流式细胞术分析血液淋巴细胞免疫表型方法学研究王建中　　摘　要　目的　研究流式细胞术（FCM）分析血液淋巴细胞免疫表型（亚群）方法学因素对实验结果的影响。方法　多参数FCM分析。结果　血液采集后1h和6h测定淋巴细胞免疫表型结果差异无显著意义（P＞0.05），而且批内、批间和总重复性均较好，但单核细胞和中性粒细胞表面白细胞共同抗原（CD45）表达有差别（P＜0.01）。用荧光/散射光设门（Back-Gating）和三色荧光/侧向散射光设门（CD45-PerCP/SSC-Gating）设置淋巴细

2、胞门（LG）时，门中淋巴细胞的百分比和门中淋巴细胞占标本中总淋巴细胞的百分比明显高于散射光设门（FSC/SSC-Gating）。用FSC/SSC-Gating和Back-Gating分析双色标记淋巴细胞免疫表型结果有显著差别（P＜0．01），但Back-Gating和T淋巴细胞门（T-Gating）分析T细胞亚群结果大致相同（P＞0.05）。单色、双色、三色免疫荧光技术分析淋巴细胞免疫表型（亚群）结果差异有显著意义（P＜0.01）。结论　FCM分析血液淋巴细胞免疫表型结果受多种因素影响。血液采集后应尽快进行免疫荧光染色和固定，最迟

3、不能超过6h；CD45-PerCP/SSC-Gating和Back-Gating分析淋巴细胞亚群优于FSC/SSC-Gating，T-Gating对T细胞亚群分析更特异。FCM分析血液淋巴细胞免疫表型（亚群）三色优于双色免疫荧光分析，单色免疫荧光分析应尽可能不采用。　　关键词：流式细胞术；淋巴细胞；免疫表型　　血液中淋巴细胞免疫表型（亚群）分析是流式细胞术（FCM）最主要的临床应用之一。由于FCM的高灵敏度、高速度和多参数分析，对血液中淋巴细胞免疫表型检测比其他方法更精确，故FCM被认为是血液中淋巴细胞免疫表型分析的标准方法［1］

4、。然而，在实验过程中多种因素均可影响FCM的分析结果［1-3］。本研究对血液标本采集后不同放置时间、不同方法设置淋巴细胞门，不同免疫荧光染色方法等重要因素对淋巴细胞免疫表型分析的影响进行了深入探讨，并评价了FCM分析淋巴细胞免疫表型的精密度，以期对日益广泛开展的FCM分析淋巴细胞免疫表型的方法选择、质量保证和临床应用等有所裨益。表1　血标本采集后放置不同时间三种白细胞CD45PerCP荧光强度（X±s）比较细胞类型1h6h8hP值淋巴细胞　615.55±59.56620.36±47.49609.98±58.560.4752单核细胞

5、　349.64±69.06418.65±40.68405.35±37.66＜0.0001中性粒细胞86.35±24.58172.37±30.82214.28±32.56＜0.0001　　注：方差分析后两两Q检验：单核细胞1h与6h、1h与8h比较P＜0.01，6h与8h比较P＞0.05；中性粒细胞1h与6h、1h与8h、6h与8h比较P＜0.01材料与方法　　一、主要试剂与仪器　　1.主要试剂：流式细胞仪校准微球（包括双色、三色微球)，免疫表型分析质控细胞（CD-Chex）。荧光素标记单克隆抗体(McAb）：（1）单色标记McAb

6、：CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD45、CD56、鼠IgG1、鼠IgG2a。（2）双色标记McAb试剂盒（SimultestIMK）：LeucoGATE（CD45/CD14）、鼠IgG1/IgG2a、CD3/CD19、CD3/CD4、CD3/CD8、CD3/CD16+56。（3）三色标记McAb：IgG1/IgG1/CD45、CD3/CD19/CD45、CD3/CD4/CD45、CD3/CD8/CD45、CD3/CD16+56/CD45、CD4/CD8/CD3。红细胞溶解剂（FACS溶解剂）。以上均为美国BD公司产

7、品。　　2.FACSort流式细胞仪，美国BD公司产品。　　二、实验方法　　血液采集、免疫荧光染色、溶血、洗涤及固定、流式细胞仪的调试、荧光标记样本的FCM分析均按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐方法［4］完成。　　三、数据分析　　数据以X±s表示。多组间数据用方差分析，两两比较用Q检验。所有数据在计算机上用SPSS统计软件分析。结果　　一、血液采集后放置时间的影响　　1.对白细胞CD45抗原表达的影响：15名正常人血液标本在采集后置室温（20～22℃）不同时间（1、6、8h）测定淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞表面的白

8、细胞共同抗原（CD45）表达量，以CD45PerCP（Peridinin叶绿素蛋白）的平均荧光强度（MFI）表示，结果见表1。　　2.对T淋巴细胞免疫表型分析结果的影响：15名正常人血标本在采集后不同时间，用IgG1/IgG1/CD45作对照，CD