仪器分析hplc复习版1011课件

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1、第三章高效液相色谱分析HPLC高效液相色谱法以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上，采用颗粒很细的固定相以及高压泵输送流动相建立的一种液相色谱法2021/7/2§3-1高效液相色谱法的特点高压150-350×105Pa高速比经典LC快数百倍,流速可达1～10mL·min-1高效大于30000塔板/米高灵敏度:10-9g（紫外检测）、10-11g（荧光检测）所需试样量很少:微升试样足以全分析试样不被破坏，易回收,分析重现性好应用范围广泛可分析80%有机化合物，尤适于高沸点、热不稳定、相对分子量大(﹥400)有

2、机及生化试样的分离分析2021/7/2相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1．分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性、沸点较低的样品，占有机物的20%HPLC：试样不需气化，只需制成溶液，即可在室温下进样分析不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、高沸点、热稳定性差及生化样品、高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%HPLC与GC差别2021/7/22．流动相的区别GC：流动相为惰性气体对组分无亲合作用，仅起运载作用。HPLC：流动相可选用不同极性的液体与组分有亲

3、合作用力，通过参与固定相对组分作用的竞争，提高柱的选择性、改善分离度，为选择最佳分离条件提供了极大方便。流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值对分离起到调控作用，选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可增大分离选择性。2021/7/23．操作条件差别GC：较高温度下进行HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）高效液相色谱法的主要缺点:仪器设备费用昂贵操作严格2021/7/2一、速率理论液体的扩散系数仅为气体的万分之一§3-2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素2021/7/21、涡流扩散项及其影响讨论：降

4、低固定相粒度可提高柱效2、传质阻力项及其影响液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径2021/7/2Hm为流动相对板高影响项Hsm为固定相微孔内流动相对板高影响项Hs为固定相（液）对板高影响项2021/7/2液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质室温（25%左右）改变流动相组成、极性是改善分离最直接的因素2021/7/21、流动相及其流速的选择二、分离条件的选择2021/7/22、2021/7/23.固定相及分离柱的选择气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相

5、色谱一样选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）首选化学键合相，湿法匀浆法装柱高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备2021/7/24．洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）2021/7/2一、液-液分配色谱LLC和化学键合相色谱CBPC固定相与流动相均为液体（互不相溶）流动

6、相：亲水性固定液，采用疏水性流动相即流动相的极性小于固定液的极性（正相NPLC）流动相的极性大于固定液的极性（反相RPLC）正相与反相的出峰顺序相反固定相—化学键合固定相§3-3HPLC的主要类型及其分离原理正相色谱主要用于极性物质的分离测定反相色谱主要用于非极性、中等极性物质的分离测定2021/7/2二、液-固吸附色谱（LSC）固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸适用于

7、分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾2021/7/2三、离子交换色谱固定相：强碱性和弱碱性阴离子交换树脂，强酸性和弱酸性阳离子交换树脂流动相：阴离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X

8、+OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等2021/7/2四、离子对色谱（IPC）原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性离子对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱离子对色谱法特