副猪嗜血杆菌的病原学检测

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1、副猪嗜血杆菌的病原学检测RESEARCHONDETECTIONOFHAEMOPHILUSPARASUIS汇报内容研究背景研究的主要内容结果与分析小结研究背景随着我国规模化养猪业的发展，副猪嗜血杆菌感染有明显增加趋势，已成为猪场保育仔猪发病率和死亡率增加的重要原因之一，造成重大经济损失。由于需要从病原学角度证实，而我国缺乏用于副猪嗜血杆菌检测的标准血清及诊断方法，因此我们开展相关研究。解决方法1分离鉴定副猪嗜血杆菌。进行副猪嗜血杆菌的流行病学调查，从而生产相对于主要流行优势菌株的疫苗。建立副猪嗜血杆菌的快速诊

2、断方法，为控制该病提供前提。研究的主要内容1．病原的分离鉴定。2．标准血清、分型方法的建立和临床应用。3．转铁结合蛋白PCR诊断方法的建立和临床应用。第一章副猪嗜血杆菌的分离鉴定病料采集剖检样品的病变表现为胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。我们采集病变的肺脏和扁桃体作为病原分离的样本。病原菌分离方法在无菌操作条件下从疑似病猪的肺脏和扁桃体等病料中取样,在巧克力琼脂平板或TSA培养基上划线接种,37℃培养48h后挑取单个菌落,转接相同的培养基再进行纯培养。涂片镜检挑取上述纯培养菌落涂片,革兰氏染色后观

3、察细菌形态。分离鉴定两株副猪嗜血杆菌分离菌株溶血性测定16srRNA－PCR鉴定两株副猪嗜血的血清型鉴定用本实验室制备的Hps标准阳性血清对本地分离菌株进行血清型鉴定。(1)琼脂扩散方法：湖北分离株血清型为5型，湖南分离株则未能检测出血清型。(2)间接血凝抑制方法:检测出湖北分离株的血清型为5型，湖南分离株的血清型为13型。分析与讨论对于Hps分离较为困难,需要在典型新鲜病料的采集、适宜的培养条件及分离者的判断经验上更为关注,才能提高其临床分离率。这两株副猪嗜血杆菌分离株对麦芽糖、葡萄糖、蜜三糖、木糖、阿拉

4、伯糖、D-核糖、接触酶、氧化酶、甘露醇、山梨糖、乳糖、尿素酶反应表现为一致,但对蔗糖、半乳糖、果糖、和H2S、山梨醇、甘露糖的生化反应不一致。第二章副猪嗜血杆菌的血清学分型方法的建立和临床应用标准抗原制备制备分离株分型标准阳性血清家兔免疫分型方法的建立检测抗原的制备盐析抗原(SaltAntigen)含菌量为1.8×109CFU/mL煮沸抗原(BoiledAntigen)含菌量为3×109CFU/mL热稳定抗原（Heat-stableAntigen）含菌量为1.8×109/mL结果分析免疫后抗体产生的规律(H

5、ps-5、Hps-1为例)Hps-1（玻片）Hps-1（琼扩）抗血清效价检测抗血清的在两种检测方法中的特异性抗血清的保存期测定将所保存的不同时期的Hps-5抗血清用于玻片凝集试验。分离株的鉴定将保存的96株副猪嗜血杆菌制作成相应的热稳定分型抗原，利用本试验制备标准阳性血清，采用琼脂扩散试验进行分型。分析与讨论标准副猪嗜血杆菌在家兔内产生抗体的强弱。本研究中探索了琼脂扩散方法和玻片凝集方法在副猪嗜血杆菌血清分型中的应用。三种分型抗原在琼脂扩散分型方法的应用。第三章副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白PCR诊断方法的建立和

6、临床应用副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白tbpB保守序列的筛选标准副猪嗜血杆菌（15个血清型）tbpB的检测该方法灵敏性、特异性检测人工感染病料和临床病料的检测讨论分析副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白tbpB保守序列的选用将tpbB-PCR检测的目的片段在NCBI网站上经过BLAST比对后发现，该基因5’端225bp到514bp（288个nt）片段在大部分Hps中保守．不同血清型副猪嗜血杆菌tbpB的检测对15种血清型的标准Hps进行扩增，由结果可知1、3、4、5、6、7、8、11、12、13、15型菌株均能通过本实验检测

7、，而9、10、14型菌株未被检测出此目的带。灵敏性试验将Hps-5型标准菌株的培养后，用比浊管测定，菌液浓度为1.25×109CFU/mL，模板稀释倍数依次为100、101、102、103、104、105、106、107、108、109后进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示。可见阳性结果的最高稀释度为稀释105倍，后取2μL做为模板，因此推算出PCR反应中最低检测量为25CFU/mL。特异性试验仅有Hps(lane1,3)扩增出目的带，而多杀性巴氏杆菌（lane4），大肠杆菌（lane5）,沙门

8、氏菌（lane6）为PCR阴性，如图6。该方法在检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌标准菌株过程中，仅在血清型9型中扩增出微弱目的带，其余为阴性，如图7。人工感染病样的检测选择猪副猪嗜血杆菌抗体阴性30日龄的猪，攻毒后收集猪死亡后的肺和脑，置-20℃保存备用,作为阳性材料；对照猪在3d后扑杀，采集肺和脑，置-20℃保存备用，作为阴性材料。图8为从组织病料中直接提取该菌基因的结果。图9为病料中细菌过夜培养后提取的基因组的检