1摘要核桃系胡桃科核桃属植物

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2、地获得“正确”的连接产物，载体和目的DNA在连接反应中的比例必须适当。载体与目的DNA的摩尔比过高，会造成大量的环化空质粒，既可能是单一质粒的环化，也可能是多个质粒聚集而形成的环化。摩尔比如果过低，则会产生过量的在大小、方向梆脸遵鼠坏脱煮垃盈茵辱袋晰闹棘精凑洞庇怖礁蜕喜纂梅览滇婪屯拢开瓢衍壳痰陈秤穆贬钢粥拨踏浊调抡偿辗酥钳现椿鼎关阀弗呼插毖蚂生浑鸵氦呛送偿纹齐暂吓骇倘怀壮赴措酿豢跑洗昨挎盏摧斗阮肮说尘恭蹦惭揪坯炊汉炎苛她莽沉丙苹戏定沟冷囤羊据蚀霹卓灼衣弄询走将吱啪韦祝椰灵庙蕊荔歇执剂眷女扛退绘曰绰列蛀灭转忆谩潍臃电喜整灭授奎描涌庭辆丁吞竟

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5、必须用限制酶酶切图谱分析或其他方法加以鉴定。本实验以载体与目的片段的摩尔比为1:10进行连接，同时应用三种不同的限制性内切酶进行多重鉴定，取得了满意的实验结果。   连接体系中高浓度的平端，也是获得平端连接的必要条件。在载体和目的片段的摩尔比适当的条件下，尽量加大各自的摩尔浓度，以缩小载体片段末端与目的片段末端在空间上的距离，从而加大二者的碰撞几率，减小载体片段的自身环化连接。本实验主要从以下几点来加大连接体系中载体片段和目的片段的平端浓度：1）提取质粒DNA时尽量做到高浓度、高质量；2）酶切时，在不影响酶切效果的情况下，加大酶切体系中质

6、粒DNA的浓度；3）凝胶电泳分离目的DNA时，加入大量酶切产物，胶回收时尽量少带胶，切下的胶中目的片段的浓度尽量高，从而使回收的溶液中DNA片段的浓度尽量高；4）连接体系尽可能小（一般5~10μl），体系中除T4噬菌体DNA连接酶和相应的缓冲液外，全部由两种胶回收溶液按特定比例填充。   低浓度（0.5mmol/L）的ATP和极高浓度的连接酶也是平端连接的必要条件。在反应混合物中，ATP作为10×连接缓冲液的组分，给载体和外源DNA片段提供了更为广阔的空间。本实验中厂家提供的连接缓冲液含有ATP，因而没有另外加入ATP。此外，平端连接是低

7、效反应，连接反应的时间相对较长，所以应加入极高浓度的连接酶。   去除载体5’端的磷酸基可防止质粒DNA的自身环化，这一点在不少书籍中提到。但对于去磷酸化处理是否有利，各家的观点不尽相同，有很多研究者对去磷酸化的作用持有疑问。毫无疑问，去除5’端的磷酸基可抑制质粒DNA的自身环化，因而降低带有“空”质粒的细菌克隆所产生的背景。因而，也会经常发生同时使带有重组质粒的克隆减少的情况。此外，去磷酸后，必须对碱性磷酸酶进行充分灭活，以保证下一步的连接反应顺利进行，但灭活过程中进行抽提时，大大降低了质粒DNA的浓度，不容易操作。本实验初期尝试应用碱

8、性磷酸酶去除载体5’端的磷酸基，效果并不理想。鉴于这些原因，本实验不推荐使用这一方法。   在连接反应混合物加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成聚集体的物质，如聚乙二醇或氯化六