蜡梅水通道蛋白基因（cpaqp）分子特征分析

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1、蜡梅水通道蛋白基因（CpAQP）分子特征分析及植物表达载体的构建张迷基金项目：重庆市教委科技项目(KJ060308)。作者简介：张迷，1984-，女，重庆城口人，硕士研究生，主要从事花卉遗传转化研究。通讯作者：李名扬，教授，博士生导师。，马婧，马鑫，胡雨晴，眭顺照，李名扬西南大学园艺园林学院，西南大学花卉研究所，重庆，400715摘要：在已构建的蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上，通过对文库cDNA克隆全长测序，得到了1个蜡梅水通道蛋白基因，命名为CpAQP(GenBank登录号为：GU433105)。cDNA全长1154bp，最大ORF810bp，编码269

2、个氨基酸。聚类分析和同源性比对表明，该蛋白基因属于TIPs亚族类，具有高度保守的MIP家族结构域。该蛋白具有6个跨膜结构，N-末端和C-末端都在细胞内。利用NetPhos2.0对CpAQP蛋白进行磷酸化位点预测，该蛋白C端丝氨酸磷酸化，可能在植物胁迫和亚细胞定位中起着重要作用。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301g中，成功构建了CpAQP基因的植物表达载体pCAM-CpAQP，为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。关键词：蜡梅；水通道蛋白；分子特征；植物表达载体水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)又称水孔蛋白，是广

3、泛存在于原核和真核生物细胞膜上转运水的特异蛋白孔道[1]。植物水通道蛋白是一个超家族：到目前为止，在拟南芥、烟草、玉米等多种植物中都发现了AQPs并得到克隆，其中玉米中有36种，拟南芥中有35种[2-4]，水稻中有33种[5]。根据氨基酸序列同源性和亚细胞定位将其划分为4种类型[6]，质膜内在蛋白PIPs(plasmamembraneintrinsicproteins)、液泡膜内在蛋白TIPs(tonoplastintrinsicproteins)、根瘤菌周膜上的NOD26类似的内在蛋白NIPs(NOD26-likeintrinsicproteins)以及一类小分

4、子碱性内在蛋白SIPs(smallbasicintrinsicproteins)。水通道蛋白在水分调节以及各种生理反应，如气孔开关、器官运动、细胞生长和生物胁迫反应等方面起着重要作用[7]。蜡梅(Chimonanthuspraecox)是蜡梅科蜡梅属落叶丛生灌木，是一种具有耐寒、耐旱等多抗特性的物种。本实验从蜡梅花cDNA文库中随机测序克隆得到一个蜡梅水通道蛋白基因，命名为CpAQP，并对其进行了序列特征分析。通过分子克隆技术，构建了一个含CpAQP基因的植物表达载体pCAM-CpAQP，为进一步研究其蛋白功能奠定了基础。1.材料和方法1.1植物材料以磬口蜡梅花的

5、各个时期（蕾期、露瓣期、初开期、盛花期）为材料构建的混合cDNA文库，由本实验室构建、保存。1.2主要试剂TaqDNA聚合酶、各种限制性内切酶、MgCl2、dNTP、T4DNA连接酶等购自TaKaRa公司；MakerDL2000等试剂购自北京天为时代科技有限公司；质粒提取和胶回收试剂盒购自BioFlux公司；PCR引物合成及DNA测序由上海生物工程有限公司完成；氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)和卡拉霉素(Kanamycin,Km)购自上海生物工程有限公司。1.3菌株与载体大肠杆菌（Escherichiacoli）菌株TOP10，根癌农杆菌（Agrobac

6、teriumtumefaciens）菌株LBA4404，植物表达载体pCAMBIA2301g（Km抗性）等均由本实验室保存。克隆载体pMD19-T购自7TaKaRa公司。1.4EST序列特征分析及蜡梅水通道蛋白cDNA序列的获得随机挑选文库克隆，提取质粒DNA，以5′pTriplEx2Sequenceprimer为测序引物，采用ABI3700DNA自动序列测定仪进行正向序列测定得到EST序列，然后运用DNAStar软件包的SeqMan进行EST聚类，运行BLASTX与nr库进行比对，获得目标克隆子(编号：CH346)，再以SP5和T7为测序引物进行两次正反向序列测

7、定，得到1个蜡梅水通道蛋白cDNA序列。1.5CpAQP基因cDNA序列鉴定及生物信息学分析根据蜡梅水通道蛋白cDNA最大开放阅读框两侧序列设计特异引物：上游引物：5‘-TCTAGAATGCCCATTTCTCGGATTGCA-3’，添加XbaI酶切位点；下游引物：5‘-GAGCTCTCAAAGACAACAAAGATGCGC-3’，添加SacI酶切位点，下划线部分表示添加的酶切位点。以蜡梅DNA和cDNA为模板，建立25μlPCR反应体系，进行PCR扩增，扩增体系为：10×PCR缓冲液2.5μL，25mMMgCl22μL，2.5mMdNTP1.5μL，引物终浓度为1

8、0μmol