国科基管函字[2008]号-生物分子高效分离与表征研究组

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1、国家重点基础研究发展计划（重大科学研究计划）项目年度报告项目编号：2012CB910600项目名称：蛋白质定量新方法及相关技术研究承担单位：中国科学院大连化学物理研究所2012年12月10日13一、年度计划执行情况1.年度计划完成情况根据课题任务书要求，2012年度主要开展了低残留的磁性材料、整体材料、蛋白质均衡器固载基质以及超细粒径分离材料的制备；发展了18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量的新方法、iTRAQ结合18O标记相对定量技术、针对非标记定量技术的归一化新算法，并编写了定量软件pQuant；建立了内标肽段制备、表征和含量测定等方法、基于多反应检测（MR

2、M）质谱技术高通量蛋白质确认策略，开展了蛋白质鉴定平台构建及其在绝对定量中的应用研究、糖肽的多反应检测质谱相对定量分析方法研究及应用、基于MALDI-MS技术的金属元素标记多重相对定量方法研究；研制了低残留蛋白质传质膜材料、缓冲溶液置换接口、亲水性酶解反应器等，开展了在线固相标记、集成化蛋白质定性和定量平台构建以及超高灵敏度蛋白质定量分析技术和系统的初步研究工作。按项目任务书的规定，全面完成任务书中要求的内容，实现了阶段性目标。已发表论文69篇，其中SCI收录64篇；申请发明专利13项，授权专利1项；培养研究生32人。2.研究工作的主要进展经过本年度的执行，各课题分

3、别取得了以下主要进展。第一课题：高效低残留的蛋白质样品处理和分离新材料在低残留的样品预处理新材料方面：1）研究了基于原子转移自由基聚合反应（ATRP）在磁性微球材料表面键合可控链长的聚合物链段的方法，探索了不同长度和种类的链段与蛋白质在材料表面残留间的关系，制备了新型的亲水性刷型聚合物磁性纳米颗粒，并将其用于大规模分析人血清糖蛋白质组，共鉴定到106个糖蛋白的204个糖基化位点；2）研究了基于可逆加成-断裂链转移自由基聚合（RAFT）制备可控链长的聚合物微球材料的方法，并结合蒸馏沉淀聚合制备了一种新型表面硼酸基团可控的核壳结构的聚合物纳米材料，实现了糖13蛋白质的高

4、选择性富集；3）分别以分子印迹材料和硼酸为高选择性配基，以点击化学为键合方式，制备了核壳卫星型高选择性配基修饰的磁性材料，实现了糖蛋白的选择性富集；4）发展了基于三磷酸腺苷配基的固定化金属离子磁性纳米材料，用于磷酸化肽富集和定量，将其检测限降至3amol，且从肝癌淋巴道高低转移细胞株中发现17条磷酸化肽段和2条磷酸化蛋白质的含量具有显著差异。4）基于比大表面积的石墨烯，研制了C8修饰的三明治结构介孔石墨烯复合物，并用于内源性肽段的富集，在鼠脑组织中选择性地富集到89个内源性肽段；5）研制了石墨烯/二氧化钛复合材料，用于磷酸化肽段的选择性富集，对磷酸化肽的检测限可以降

5、至2×10-9M；6）研制了具有等级孔结构的含钛磷酸铝5型分子筛介孔材料，并将其成功用于磷酸化肽的高选择性富集。在蛋白质均衡器技术方面：发展了基于噬菌体展示单链可变区片段文库（scFv@M13）为配基的蛋白质均衡器，并将其用于血清蛋白质组样品。经均衡器处理血清后，鉴定蛋白数目从280个提高到560个，展示了该技术在高丰度蛋白质去除和低丰度蛋白质富集方面、以及提高蛋白质组鉴定覆盖率方面的重要作用。在蛋白质组样品分离材料方面：1）制备了粒径分布较窄、粒径可控的亚2μm核壳结构硅胶色谱填料基质，并实现了多肽的快速分离；2）采用苄基甲基丙烯酸酯和硅氧烷为原料，通过“一锅法”

6、制备了苯基-硅胶杂化整体柱，最小理论塔板高度为8.38µm，对应的理论塔板数为119,000理论塔板数/米，对6种蛋白的酶解产物进行了分离分析，计算得到12cm整体柱的峰容量为144；3）通过一步升温的改进型“一锅法”制备了两亲性的有机-硅胶杂化整体柱，对肽段混合物进行分离，最高柱效可达到110,000理论塔板数/米；4）基于“巯基-烯烃”的点击化学反应这一固定相键合新方法，设计了新型的两性离子亲水作用色谱固定相，该固定相不仅具有优异的分离选择性和分离效率，还克服了常用亲水作用色谱固定相化合物适用范围窄的问题；5）基于水平共聚的技术，发展了反相/弱阳离子交换（C18

7、/WCX）的混合模式色谱固定相，在不同pH条件下，C18/WCX柱与C18的正交性优于商品化C18固定相的正交性。13第二课题：复杂生物体系中低丰度蛋白分离富集新技术研究在一级质谱定量方面：建立了基于质谱技术和针对多肽N-端氨基标记的金属元素标记蛋白质组多重定量新方法，并成功地初步应用于四个不同温度培养的腾冲嗜热菌的差异蛋白组的研究。在二级质谱定量方面：发展了18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量新方法。该方法针克服了前期所发展的基于二级质谱by离子定量方法的局限性，是一种适用于所有蛋白样品分析、基于常规的胰蛋白酶酶解、价格低廉的等重标记的b,y离子对二级质谱