基因相关肽的制备及其应用的初步研究.doc

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1、基因相关肽的制备及其应用的初步研究摘要】目的:对hPTH(134)进行结构改造，提高蛋白水解酶的稳定性，增强酶活性，使之更适合制成滴鼻剂，并验证治疗骨质疏松症的效果。方法：确定将hPTH(134)改造成为ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro后，构建表达质粒pED4PhPTH(134)，转化E.coliBL21(DE3)LysE，乳糖诱导表达，经分离纯化获得目的多肽。将目的多肽与二甲基β环糊精、聚丙烯酸、EDTA制成滴鼻剂，治疗卵巢摘除大鼠（OVXedRats）的骨质疏松症。结果：获得纯

2、度较高的ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro，将制成的滴鼻剂用于卵巢摘除大鼠，与生理盐水滴鼻治疗组相比能显著增加大鼠椎骨骨密度（P<0.01）及股骨头骨小梁厚度（P<0.001），对鼻黏膜没有损伤。结论：ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro制成滴鼻剂治疗卵巢摘除大鼠的骨质疏松症效果明显，有进一步开发的前景。【关键词】人甲状旁腺素滴鼻剂骨质疏松症骨密度骨小梁骨质疏松症是一种老年人和绝经后妇女的常见疾病，容易造成骨折，降低生活自理能力。甲状旁腺素（PTH）是一

3、种由甲状旁腺分泌的激素，由84个氨基酸组成，是血钙的主要调节剂之一[1]。PTH小剂量多次给药具有明显的成骨作用，PTH（134）则完全保留了这种活性，所以PTH（134）成为目前治疗骨质疏松的理想药物[12]。PTH及其相关肽类药物都采用注射给药，频繁给药给患者带来极大的不便和痛苦。与注射剂相比滴鼻剂具有使用方便、患者依从性较好等特点，因此开发PTH（134）的滴鼻剂具有广阔的市场前景。多肽类药物滴鼻给药，透过鼻黏膜吸收比较困难，而且易被吸收过程中的蛋白酶所降解[3]，除了从药剂学上来解决此问题，我们认为有必要对hP

4、TH（134）进行结构改造。结构改造有两个目的，一方面为了增强其对蛋白酶的稳定性，避免吸收过程中酶的降解，另一方面增强其活性，弥补多肽类药物生物利用度较低的不足。经过查阅文献，我们选定将hPTH（134）改造为ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro，采用基因工程的方法来获得该肽，并制成滴鼻剂治疗卵巢摘除大鼠的骨质疏松症验证其药效。1材料与方法1.1材料pET28ansBC为本实验室构建保存，pET28a购自TaKaRa公司，大肠杆菌BL21（DE3）为本实验室保存，CM52购自Whatman

5、公司，二甲基β环糊精（DMβCD）购自Sigma公司，SD大鼠由中国药科大学动物实验中心提供，其他试剂均为进口分装或国产分析纯。1.2方法61.2.1ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro表达和纯化通过PCR方法我们合成编码ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro的DNA片断，并将其插入质粒pET28ansBC的BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点之间得到表达质粒pED4PhPTH(134)。在该表达质粒中，ProPro[Arg11]hPTH(134)P

6、roPro是通过酸敏感位点AspPro连接到大肠杆菌门冬酰胺酶Ⅱ的C端127肽基因片段后。将该质粒测序验证后，转化E.coliBL21(DE3)LysE后进行表达，然后经包涵体洗涤，8mol·L-1尿素溶解，乙醇分级沉淀获得融合蛋白，再经酸水解，CM52柱层析获得目的多肽。1.2.2ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro的HPLC分析反相柱为ShimpackCLCODS6.0mmID×15cm，A相为0.1%的三氟乙酸水溶液，B相为纯乙腈，梯度为B相从20%到70%，洗脱时间为20min，

7、流速为1ml·min-1，检测波长为280nm，进样量为20μl，温度为室温。1.2.3ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro滴鼻剂的制备及对卵巢摘除大鼠骨质疏松症的治疗将不同质量浓度的ProPro[Arg11]hPTH(134)ProPro（2.500、1.250和0.625mg·ml-1）、DMβCD(40mg·ml-1)、聚丙烯酸（2.5mg·ml-1）及EDTANa（0.1mg·ml-1）溶解到生理盐水中，调pH6.0，配制成高、中、低3个浓度的滴鼻剂。将48只200g左右的

8、大鼠按体质量分为正常对照（Normal）组，假手术（Sham）组，生理盐水（NS）组，和高、中、低剂量（HhPTH，MhPTH，LhPTH）组，每组8只。对除正常对照组外其余大鼠进行卵巢摘除手术。饲养2周后，高、中、低剂量组每日滴鼻相应浓度滴鼻剂80μl，生理盐水组每日滴鼻生