大肠菌群检验操作规程

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1、汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司文件编码第6页共6页大肠菌群计数检验操作规程颁发部门质量部新订■修订□复审□页数共2页文件性质管理标准■操作标准□技术标准□文件编码原编编码起草年月日审核年月日批准年月日QC年月日执行日期年月日分发部门质量管理部、QC一、目的建立大肠菌群计数检验的标准操作程序，使操作过程规范化。二、适用范围适用于大肠菌群计数的检验操作。三、职责1.检验人员严格按检验操作规程进行检验。2.QC主管监督检查执行情况。四、程序1.范围本方法适用于大肠菌群计数（coliforms）的测定2.术语和定义

2、2.1大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。3.设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。3.2冰箱：2℃～5℃。3.3恒温水浴箱：46℃±1℃。3.4天平：感量为0.1g。3.5均质器。3.6振荡器。3.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司文件编码第6页共6页刻度）或微量移液器及吸头。3.8无菌锥形瓶：容量500mL。3.9无菌培养皿

3、：直径90mm。3.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。3.11菌落计数器。4.培养基和试剂4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。4.2煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤：见附录A中A.24.3磷酸盐缓冲液：见附录A中A.3。4.4无菌生理盐水：见附录A中A.4。4.5无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.5。4.6无菌1mol/LHCl：见附录A中A.6。汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司文件编

4、码第6页共6页5.检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。检样25g(mL)样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释选择3个适宜稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管36℃±1℃48h±2h不产气产气BGLB肉汤36℃±1℃48h±2h产气不产气大肠菌群阳性大肠菌群阴性查MPN表报告结果图1大肠菌群MPN计数法检验程序6.操作步骤6.1样品的稀释6.1.1固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或

5、放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。6.1.3样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司文件编码第6页共6页调节。6.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL

6、磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。6.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。6.2初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1m

7、L，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。6.3复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。6.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。汉臣氏（

8、沈阳）儿童制品有限公司文件编码第6页共6页附录A（规范性附录）培养基和试剂附录A.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水1000mLpH6.8±0.2A.1.2制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高压