大鼠肠巨噬细胞肠上皮细胞分泌TNFa的规律及药物作用的研究

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1、大鼠肠巨噬细胞肠上皮细胞分泌TNFa的规律及药物作用的研究作者：温志新，王辉，陈海龙，范琦，李文利【摘要】目的：本实验利用体外单独培养的肠巨噬细胞、肠上皮细胞及二者混合细胞,通过脂多糖(LPS)刺激及地塞米松(DEX)、TNFa单克隆抗体及复方清下汤作用，探讨肠巨噬细胞、肠上皮细胞的TNFa分泌及以上三种药物的影响。方法：体外培养肠巨噬细胞、肠上皮细胞及二者混合细胞，三种细胞除对照组外，都用LPS诱导，同时一部分细胞再经DEX、TNFa单克隆抗体及复方清下汤分别处理，培养６h后取上清液。应用放免法检测T

2、NFa。结果：正常肠巨噬细胞可分泌少量的TNFa。LPS诱导组分泌显著增加，DEX、TNFa单克隆抗体及复方清下汤处理组与脂多糖诱导组相比分泌显著降低。正常肠上皮细胞可分泌少量的TNFa，但LPS诱导组与正常对照组及药物处理组与LPS诱导组之间差异无显著性。混合细胞结果与肠巨噬细胞相同。结论：肠道屏障受破坏时，门静脉血中TNFa明显增高，这主要与肠巨噬细胞在内毒素刺激下分泌增多有关，与肠上皮细胞无明显关系。DEX、TNFa单克隆抗体及复方清下汤均可抑制肠巨噬细胞分泌这三种物质。DEX、TNFa单克隆抗体

3、及复方清下汤具有肠黏膜屏障的保护作用。【关键词】肠巨噬细胞；肠上皮细胞；肿瘤坏死因子；肠道屏障TNFa是一个具有１５７个氨基酸的蛋白,是机体的早期炎性介质,在炎性介子连锁反应中起重要作用。本实验利用体外单独培养的肠巨噬细胞、单独肠上皮细胞及二者混合的细胞,通过脂多糖(LPS)刺激及地塞米松(DEX)、TNFa单克隆抗体及复方清下汤作用探讨肠巨噬细胞及肠上皮细胞TNFa的分泌及以上三种药物的影响。1材料与方法材料1SD雄性健康大鼠，220g～250g。由大连医科大学实验动物中心提供。DMEM培养基、RPM

4、I1640培养基、等渗细胞分离液、胶原酶IV(CollagenaseIvSIGMA公司)、大鼠TNFa放免检测试剂盒、NO检测试剂盒。中药：复方清下汤，由大黄、芒硝、枳实、川朴等10位中药组成，经抽提、过滤制成精制药液。方法组织制备肠上皮细胞分离［1］：动物以密闭CO2笼处死,迅速取全肠，用50ml冷PBS(pH=)冲洗肠腔。纵向剖开，置入含%EDTA的无钙、镁Hanks平衡盐溶液中，3℃水浴中振荡20min后，收集上清，用于分离肠上皮细胞；肠巨噬细胞的分离［1］：所取组织继续以HBSS/EDTA消化4

5、0min，然后用５％胶原酶Ⅳ的含钙、镁的Hanks液继续振荡消化h。所得细胞悬液以5μm尼龙网过滤得单个细胞；分离肠上皮细胞：第一次EDTA处理的细胞悬液以HBSS洗2遍，悬于40%等渗的细胞分离液中。100rpm离心，℃，1min。收集上层细胞(含有98%肠上皮细胞)，用HBSS洗3遍，以DMEM调细胞浓度为4×105/ml。用胎盘蓝染色，细胞活力为80%。以碱性磷酸酶标记的单克隆抗体进行细胞染色，肠上皮细胞纯度为98%(染色阳性的为肠巨噬细胞)。分离肠巨噬细胞：经胶原酶处理的细胞悬液，以HBSS洗涤

6、。悬于50%等渗的细胞分离液后，离心，000rpm，℃，1min。收集细胞沉淀，以无钙、镁的HBSS洗3遍，RPMI1640培养基调细胞浓度为4×105/ml。实验分组肠巨噬细胞组：取24孔培养板，每孔加入肠巨噬细胞悬液及DMEM培养基，取三孔作正常对照，其余各取三孔分别加入４０μlLPS终浓度(10ug/ml）,20μl及20μlDEX(终浓度为10mmol/l），20μlLPS(终浓度10ug/ml）及20μlTNFa单克隆抗体，20μlLPS(终浓度10ug/ml）及20μl复方清下汤。对照组加

7、４０μl生理盐水；肠上皮细胞组：24孔培养板，每孔加入肠上皮细胞悬液及PRMI1640培养基。取三孔作为正常对照，其余各取三孔分别加入４０μlLPS(终浓度10ug/ml）,20μlLPS(终浓度10ug/ml）及20μlDEX(终浓度10mmol/l），20μlLPS(终浓度10ug/ml）及20μl复方清下汤。对照组加４０μl生理盐水；肠巨噬细胞及肠上皮细胞混合组：取24孔培养板，每孔加入肠巨噬细胞悬液及肠上皮细胞悬液。取三孔作为正常对照，其余各取三孔分别加入４０μlLPS(终浓度10μg/ml）

8、,20μlLPS(终浓度10μg/ml）及20μlDEX(终浓度10mmol/l），20μlLPS(终浓度10μg/ml）及20μlTNFa单克隆抗体，20μlLPS(终浓度10μg/ml）及20μl复方清下汤。对照组加４０μl生理盐水。各培养板于3℃%CO2培养箱中培养h，取上清液检测TNFa。检测方法TNFa检测：放免法，按试剂盒操作。统计方法实验数据用±s表示,结果应用进行统计分析。结果　　　　TNFa浓度由表1可见,肠巨噬细胞正常