生物化学实验报告 2010

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1、孝感学院生命科学技术学院实验报告专业：学号：姓名：分数：实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的与要求掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中

2、还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉(1000g)2．主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11（2）滤纸（3）烧

3、杯：100mL×2（4）三角瓶：100mL×1（5）容量瓶：100mL×3（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1（7）恒温水浴锅（8）煤气炉（9）漏斗（10）天平（11）分光光度计3．试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5gDNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000mL容量

4、瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000mL。（3）碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。（5）6MHCl和6MNaOH各100mL。（分别取59.19mL37%浓盐酸和24克NaOH定容至100mL）四、操作步骤1.制作葡萄糖标准曲线批阅教师：年月日取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄

5、糖含量的反应液。表1葡萄糖标准曲线制作管号1mg/mL葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）光密度值（OD540nm）0021.50 10.21.81.50.2 20.41.61.50.4 30.61.41.50.6 40.81.21.50.8 51.01.01.51.0 61.20.81.51.2 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，用冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀。调分光光度计波长至540nm，用0号管调零点，等后面7~10号管准备好后，测出1～6号管的光

6、密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。光密度值葡萄糖标准曲线葡萄糖含量（mg）2.样品中还原糖和总糖的测定（1）还原糖的提取准确称取3.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出。过滤，将滤液全部收集在100mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。（2）总糖的水解和提取准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL6MHCl，置沸水浴

7、中加热水解30min,取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6mol/LNaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100mL，过滤取滤液10mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。（3）显色和比色取4支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比

8、色。调波长540nm，用0号管调零点，测出7～10号管的光密度值。表2样品还原糖测定管号还原糖待测液（mL）总糖待测液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）光密度值（OD540nm）查曲线葡萄糖量（mg）平均值70.5 1.51.5  80.5 1.51.5  9 111.5