细胞工程与干细胞

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1、细胞工程与干细胞(CellEngineeringandStemCell)应用细胞生物学和分子生物学技术，根据人们的意愿对细胞的遗传性状进行定向改造，以获得细胞产品、药品或医用生物材料的综合技术体系。细胞工程细胞工程的分类植物细胞工程动物细胞工程微生物细胞工程细胞整体层次：如细胞培养、细胞融合等；细胞器层次：如核移植、染色体倍性或组成改变等；分子层次：如基因操作技术等。动物细胞工程所涉及的细胞结构层次第一节体外细胞培养细胞培养（cellculture）指单个细胞或细胞群在体外条件下的培养技术，可以分为原代细胞培养和传代细胞培养。细

2、胞系（cellline）原代细胞经首次传代成功后的细胞。细胞株（cellstrain）从一个经过生物学鉴定的细胞系中用单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成具有特殊性质或标志的细胞群。一、细胞的大规模培养1.增加培养容积直接向培养液中充氧。深层全自动气升式培养缸的容量：5升、30升、100升，1000升。（一）增加培养容积和细胞可附着面积目前应用较多的培养系统包括：微载体（☆☆☆☆☆）、中空纤维、微胶囊固化细胞培养系统等。微载体要求对细胞无毒性，不影响营养成分，大小适于被悬浮搅拌，可供细胞良好生长、透明无色以便观察和检查

3、。2.增加细胞可附着面积细胞凋亡是导致培养器中细胞死亡的主要原因。在大规模动物细胞培养条件下，细胞凋亡／死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生。“细胞静止”态可以有效降低营养成分消耗和代谢毒物产生，提高目的蛋白产率。（二）抑制细胞的凋亡二、无血清培养组成成分明确、质量一致、蛋白含量低；有利于提高细胞产品生产的稳定性，并使细胞产品易于纯化；可通过对培养基成分的优化，使不同的细胞在最有利于其生长或有利于表达目的产物的环境中持续高密度培养。（一）无血清培养基的优点基础培养基：Ham’s-F12、DMEM、RPMI1640等。附

4、加成分促生长增殖成分：转铁蛋白、硒酸钠、胰岛素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、生长激素等。促贴壁附着成分：纤粘连蛋白(fibronectin)、层粘连蛋白、胶原蛋白、多聚赖氨酸等。（二）无血清培养基的组成第二节细胞核移植是指将一个双倍体的细胞核与另一个已将细胞核除去的卵细胞质重组在一起后，在一定条件下，能像受精卵一样启动发育并形成胚胎、幼体和成体的技术。细胞核移植(nucleartransfer)一、技术路线卵细胞成熟卵母细胞(☆☆☆☆☆)（一）受体细胞的选取胚胎细胞、未分化的原始生殖细胞、胎儿细胞乃至高度分化的成年动物细胞

5、都可以作为供核细胞。（二）供体核的获得（三）核质融合电融合法重组卵需经一定时间的体外培养，或放入中间受体动物输卵管内孵育。家兔、猪在移植入受体子宫前约需体外培养24h。而牛、羊一般培养发育至桑椹胚期或囊胚期。（四）重组卵的培养和植入母体二、体细胞核移植高度分化的成体动物细胞核仍具有发育的全能性。当供体核处于S期时，受体细胞质中高水平的MPF使染色体出现异常的几率显著升高，而当供体核处于G1或G2期时，虽然供体核同样会出现早熟凝集染色体，但对染色体没有损害。G2－PCC近于M期染色体，螺旋化程度低，染色浅，细长，姐妹染色单体靠得近

6、。S－PCC粉末状G1－PCC早G1期，短而粗；晚G1期，细而长。协调供体核和去核卵母细胞的途径1.选取处于GO或Gl期的细胞做核供体Wilmot血清饥饿法（0.5％）克隆羊2.选取低MPF水平的卵母细胞做受体（一）供体核和去核卵母细胞的选择277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。1.采用人工捕获的方法通过限制细胞培养基中的某种成分，从而使大部分细胞滞留在细胞周期的某一阶段。2.选择G0、G1期细胞所占比例较高的细胞类型作供核细胞刚排出的卵母

7、细胞周围的卵丘细胞(90％以上)。（二）获取G0或Gl期细胞的方法TraditionalcrossbreedingRecombinantDNAtechniques第三节基因转移选择合适的受体细胞肿瘤细胞与正常细胞生理特性接近的细胞系要有可靠的转化后筛选方法针对细胞抗药性的筛选方法一、物理学方法（一）电穿孔法采用电脉冲，简单而广泛运用于培养细胞的基因转移，基因转移效率最高可达10－3。（二）显微注射法胚胎期注入目的基因，应用范围广，转基因长度可达数百kb。（三）DNA直接注射法最简单的基因转移方法。如能进一步提高基因转移效率，该方

8、法发展前景广大。二、化学方法（一）DEAE-葡聚糖法对许多细胞类型的转化率极低。（二）磷酸钙共沉淀法转化率至少是DEAE-葡聚糖法的100倍。（三）脂质体包埋法脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层包围的囊状结构。基因转移效率很高，据报道，最高时100％离体