分子病理学常用研究技术原理及应用

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1、分子病理学常用研究方法原理及选择实验方法在科研工作中的意义决定本项研究的意义与水平：①高水平假说+高精尖手段→高水平的研究②高水平假说+一般手段→高水平的研究③低水平假说+高精尖手段→一般水平的研究④低水平假说+一般手段→低水平的研究FromProf.XWBian工欲善其事必先利其器立题的先进性手段的先进性科研水平先进性选择实验方法的基本原则必要性可行性为什么要选择这个方法替代方法经费实验室条件时间基于硬件条件，选择最具有说服力的方法1．为没有工作经验的医学研究生编写一本适合自学的手册式教材，为他们做课题时更快、更好地选择合适的实验技术提供

2、决策参考。2．重点介绍同类实验技术的发展沿革、优劣比较；不同实验技术的特点、用途、相互关系、发展趋势；各类实验技术的关键、操作要点和选择示范。3．重点强调医学实验技术的原理与选择，而非具体操作，亦非理论知识。常用医学实验动物模型的种类及选择组织学实验技术细胞生物学实验技术分子生物学实验技术蛋白质化学技术免疫学实验技术医学微生物学实验技术医学实验技术原理及选择分子病理学常用实验方法组织标本取材与固定病理制片切片染色：常规/特殊原位蛋白质检测原位核酸检测组织取材固定不固定冻存（不提倡）冻存包埋冰冻切片HE染色特殊染色IHCISH电镜蛋白质、核酸提

3、取固定不固定分子生物学实验-20℃保存IF/IHC/ISH组织标本一般处理流程细胞标本一般处理流程活细胞细胞爬片细胞离心涂片细胞培养离心后包埋制片冻存细胞悬液固定形态学IHCISHProtein/DNA/RNA分子生物学IF、FCM印片法穿刺法沉淀法细胞爬片法适用范围活检组织标本、手术切除标本的细胞取材实质器官的病变区细胞取材体液多细胞少的标本有贴壁生长特性的细胞，如纤维母细胞、粘液癌细胞优点简便省时，细胞抗原保存较好操作简便，细胞形态保持较好操作简便，细胞形态保持较好操作简便，保持细胞形态及活性缺点细胞分布不均匀，易重叠，影响标记效果细胞分

4、布不均匀细胞分布不均匀，易重叠，影响标记效果适用细胞种类较少细胞取材方法适用范围及优缺点比较组织固定定义：将组织浸入适当化学试剂，使细胞内物质尽量接近其生理状态时的形态结构和位置的过程意义：防止自溶防止腐败最大限度保存细胞和组织的抗原性保留特殊成分：糖原、核酸、色素等组织固定的方法蒸汽固定法浸入法灌注法微波固定法某些薄膜组织及血液或细胞涂片中的可溶物质手术取材组织标本和细胞涂片仅适用于动物实验常用固定剂醛类固定剂非醛类固定剂丙酮及醇类固定剂双功能交联剂，可使组织间相互交联，原位保存抗原对组织穿透力强，收缩性小是最常用固定剂10%中性福尔马林液

5、4%多聚甲醛缓冲液适用于多肽类激素的组织固定常需与戊二醛或多聚甲醛混合适用降低边缘效应穿透性很强，保存抗原活性较好常用于冰冻切片及细胞涂片固定2.5%戊二醛（电镜）组织病理制片技术常规组织病理制片脱水，透明，浸蜡，包埋，切片组织病理制片技术组织芯片近年来基因芯片（DNA芯片）技术的发展和延伸，与细胞芯片、蛋白芯片、抗体芯片一样，属于特殊生物芯片技术组织芯片技术可将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样本的分析工具科研人员可同时研究几百甚至上千种不同阶段病理生理状态下的组织样本的某一

6、个或多个特定基因或相关表达产物TissueMicroarray组织病理制片技术显微切割：microdissection选取同质性研究材料，是在对组织的深入研究中常常遇到却又不易解决的问题该技术是在显微状态下或显微直视下通过显微操作系统对选择的材料（组织、细胞、细胞群、细胞内组分或染色体带等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术细微：微米、纳米级切割原位：所取材料定位清楚同质：所取材料在一定层次上相同结合：与其他实验技术结合显微切割技术的特点显微切割本身不能对样品进行研究，必须同其他实验技术结合，其切割目标完全取决于研究目的显微切割的方式手动直

7、接显微切割机械辅助显微切割液压控制显微切割激光捕获显微切割（lasercapturemicrodessection,LCM）全自动组织处理机石蜡包埋机石蜡切片机震荡切片机硬组织切片机冰冻切片机冰冻切片机常用组织切片染色方法未经染色的组织切片各部分折射率差别很小，即使有足够的分辨率和合适的放大倍数，也无法直接在光镜下观察。通过适当的染色，增大各部分结构折射率差别，提高分辨率苏木精－伊红染色（HE）HE染色能非常鲜明地对组织和细胞染色，是最基本、使用最广泛的技术方法，又被称为常规染色。DNA带负电荷，呈酸性，与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢

8、键形式结合，呈蓝色伊红Y为一种合成酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与嗜酸性物质结合呈红色特殊染色显示HE染色不明显的目的物，如Gridley染色能突出显示感