苯甲酸钠与溶菌酶的作用机制的研究

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1、长治学院学士学位论文目录关键词2引言21实验部分31.1仪器与试剂31.2实验方法31.2.1荧光光谱的测定31.2.2同步荧光光谱法的测定32结果与讨论42.1荧光光谱及荧光猝灭机制42.1.1荧光光谱42.1.2猝灭类型42.2结合位点数n与结合常数K的确定52.3苯甲酸钠与溶菌酶色氨酸残基间结合距离的计算62.4热力学参数与作用力类型的确定72.5苯甲酸钠与溶菌酶间的结合部位83结论9参考文献10Abstract12Keywords12致谢13１２长治学院学士学位论文苯甲酸钠与溶菌酶的作用机制的研究摘要：在模拟人体生理条件下，采用荧光光谱法研究苯甲酸钠与溶

2、菌酶之间的相互作用，计算了其集合常数、结合位点数，并探讨了苯甲酸钠对溶菌酶构象的影响。研究苯甲酸钠对溶菌酶内源性荧光产生的强烈的猝灭过程为静态猝灭。苯甲酸钠也溶菌酶形成1：1复合物，在308K温度下的结合常数K是1.54×105，结合距离r=0.126nm。研究结果表明，苯甲酸钠与溶菌酶的相互作用有重要影响。溶菌酶与苯甲酸钠的同步荧光光谱也表明，溶菌酶的构象在作用前后基本不变。关键词：苯甲酸钠；溶菌酶；荧光光谱法；同步荧光光谱法引言溶菌酶（Lysozyme,LYSO）是一种存在于生物体内的小分子碱性蛋白，也是生物体内必不可少的非特异性体液免疫因子[1]，能与许多

3、内、外源物质结合，因而常被用作研究药物小分子与蛋白相互作用的模型蛋白。目前有关溶菌酶的研究较多[2-3]，而其与苯甲酸钠的相互作用的研究尚未见报道。苯甲酸钠（Sodiumbenzoate）又称:安息香酸钠。产品规格：工业级、食品级。分子式:C7H5NaO2。分子量:144。其分子结构见图1。图1性状:白色颗粒或结晶性粉末。无气味，有甜涩味。苯甲酸在常温下难溶于水，在空气（特别是热空气）中微挥发，有吸湿性，大约常温下0.34g/100mL１２长治学院学士学位论文；但溶于热水；也溶于乙醇、氯仿和非挥发性油。在使用中多选用苯甲酸钠；苯甲酸和苯甲酸钠的性状和防腐性能都差

4、不多。苯甲酸钠大多为白色颗粒，无臭或微带安息香气味，味微甜，有收敛性；易溶于水（常温）53.0g/100mL左右，PH在8左右；苯甲酸钠也是酸性防腐剂，在碱性介质中无杀菌、抑菌作用。苯甲酸钠亲油性较大，易穿透细胞膜进入细胞体内，干扰细胞膜的通透性，抑制细胞膜对氨基酸的吸收；进入细胞体内电离酸化细胞内的碱储，并抑制细胞的呼吸酶系的活性，阻止乙酰辅酶A缩合反应，从而起到食品防腐的目的。苯甲酸钠对人的长期毒性尚不很明确，特别是婴儿是否有把苯甲酸钠转化为马尿酸的转化酶系未知[4]，因此研究苯甲酸钠的毒性具有现实意义[5]。　　本文采用荧光光谱法、同步荧光法、紫外光谱法对

5、苯甲酸钠与溶菌酶的相互作用进行了研究，对于理解苯甲酸钠作防腐剂的作用机理有重要的理论和现实意义。1实验部分1.1仪器与试剂F-4600荧光仪（日本日立）、PHS-3B数字酸度计（上海精科）、U-3900紫外分光光度计（日本日立）、FA2004B电子天平（上海越平科技仪器有限公司）。苯甲酸钠（天津市北辰方正试剂厂）、溶菌酶（Sigma公司）、三羟基氨基甲烷（Tris）(湖南湘中化学试剂有限公司)、实验用水为二次蒸馏水。1.2实验方法1.2.1荧光光谱的测定移取200μL8×10-5mol·L-1溶菌酶于10mL量筒，再分别移取2mLPH=7.4的Tris-HCL、

6、0.1mol·L-1NaCl溶液于该量筒中，然后用蒸馏水将该混合液稀释至10mL。用可调式移液器移取2mL上述溶液于石英池中，再用可调式移液器移取苯甲酸钠溶液进行荧光滴定，混合均匀后，以280nm为激发波长，在荧光光度计上记录300～500nm波长范围内的发射光谱，狭缝宽度均为2.5nm。1.2.2同步荧光光谱法的测定固定溶菌酶的浓度，逐渐滴加苯甲酸钠溶液，分别在Δλ=15nm和Δλ=60nm下扫描荧光激发光谱，得到溶菌酶中酪氨酸和色氨酸残基的同步荧光光谱。１２长治学院学士学位论文2结果与讨论2.1荧光光谱及荧光猝灭机制2.1.1荧光光谱在308K时，苯甲酸钠与

7、溶菌酶相互作用的荧光光谱图见图2。随着苯甲酸钠的浓度的增加，溶菌酶的内源荧光强度有规律地降低，但发射峰形基本不变，说明苯甲酸钠对溶菌酶的荧光有显著地猝灭作用。本文所用荧光强度为考虑稀释效应后的值。图2308K时苯甲酸钠对溶菌酶荧光光谱影响2.1.2猝灭类型药物对蛋白质荧光的猝灭主要分为动态猝灭和静态猝灭两类[6]。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用过程，其作用过程遵循Stern-Volmer方程[7]：I0F/IF=1+KSV[Q]=1+kqτ[Q]（1）式中，I0F和IF分别为溶菌酶和苯甲酸钠作用前后的荧光强度，[Q]为苯甲酸钠的浓度，KSV

8、为Stern-Volme