考马斯亮蓝法测定青霉素发酵液中可溶性蛋白质含量

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1、万方数据羹炎；兰臀端专举；：

2、丝兰墨鱼兰銎兰墨娄分析与测试羹—————竺——————————墼考马斯亮蓝法测定青霉素发酵液中可溶性蛋白质含量安志强，孙新顺，乔文庆(石药集团中润制药(内蒙古)有限公司，内蒙古呼和浩特010206)[摘要]以青霉素发酵液为原料，利用蛋白质与考马斯亮蓝显色原理，测定发酵液中蛋白质含量，并对检测方法进行验证，检测波长为595nm。蛋白质含量在O～30pg／mL时与吸光度有良好的线性关系，测定所需标准曲线方程为f-O．0039对0．0488。采用考马斯亮蓝法测定青霉素发酵液中蛋白含量具有速度快、精确度高、重现性好等特点。[关键词】发酵液；考马斯亮蓝法；蛋白

3、；测定[中图分类号】Q946．1[文献标识码]B[文章编号】1003—5095(2010)09—0060-02蛋白质含量测定目前常用的方法有凯氏定氮仪法、双缩脲法(Blurer)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法(Bradford)。其中Bradford法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上叫。考马斯亮蓝法其检测原理是根据染料考马斯亮蓝与蛋白分子结合形成特异的吸收峰，并在一定的蛋白浓度范围内，吸收峰的大小与蛋白含量成正比来定量溶液中的蛋白质圆。考马斯亮蓝R-250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在O～l000ll

4、g范围内，蛋白质一色素结合物在595IlIll下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定∞。青霉素发酵液是一种成分非常复杂的混合液，在其混合液中含有一定的蛋白。蛋白含量的大小，严重影响着青霉素发酵液的过滤效果和产品质量，因此，测定青霉素发酵液中的蛋白意义重大。l材料考马斯亮蓝R250，天津市光复精细化工研究所；95％乙醇，天津市风船化学试剂科技有限公司；85％磷酸，天津市风船化学试剂科技有限公司：氯化钠，天津市风船化学试剂科技有限公司；牛血清血蛋白，北京奥博星生物技术有限责任公司；蒸馏水。721玻璃比色皿，宜兴市晶科光学仪器有限公司；722S型分光光度计，上海研润光机科技有限

5、公司。2方法【收稿日期]2010-06—25【作者简介]安志强(1970-)，男，工程师，从事抗生素生产管理工作。2．1考马斯亮蓝试剂将考马斯釉{250100mg溶于50mL95％乙醇中，加入100mL85％H3P04，用蒸瑶榈希释至l000mL，试剂与水混合均匀后再用滤纸过滤。最终试剂中含0．01％(w／D考马斯亮蓝R250、4．75％(∥v)乙醇、8．5％(w／DH3PO。。2．2标准蛋白质溶液用纯的牛血清蛋白同O．15mol／LNaCl按照比例配制成100Ilg／mL的标准蛋白溶液。2．3发酵液样品的制备取发酵液lOmL于500mL烧杯中，加入390mL蒸馏水，混合均匀(发

6、酵液中蛋白含量较高，需将其稀释)。2．4标准曲线的制作(表1)表1盥色编呈Q123§昼楗茗脘o．oo．5l1．522．530．15mol／LNaCl／mL109．598．587．57耋墨堑丕堇亟型』些盟塑!!婴i!依次将混合液按照表1顺序配比、摇匀，2h内以0号为空白对照，在595nm处比色，以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标绘制标准曲线，如图l所示。0．140．120．10．∞0．060．04O．02O／／?‘／／一，5lO15∞25∞∥llg·mL-I图1蛋白含量标准曲线从图1可以看出，考马斯亮蓝法测定的蛋白为一万方数据第9期安志强：考马斯亮蓝法测定青霉素发酵液中可

7、溶性蛋白质含量·61·条标准曲线。曲线方程：y=rx+O．0488(经计算r=0．0039)2．5样品蛋白质含量的测定按照比例将青霉素发酵液与NaCI溶液配制成10mL样品溶液，与50ⅡlL考马斯亮蓝溶液混合均匀，以O*管为空白，在595nm下测定其吸光度，根据标准曲线方程计算出青霉素发酵液中蛋白含量。以浓度为100lIg／mL的牛血清蛋白液作标准，于一20℃环境中保存。在利用分光光度计测量吸光度时，所用的比色皿应该是塑料或玻璃的，并且用之前应绝对保证清洗干净，禁止使用石英比色皿(成分为二氧化硅)，因为染料可以和二氧化硅发生共价结合闽，而染料沾到玻璃或塑料比色皿上时，可以用甲醇或

8、清洗剂清洗掉。青霉素发酵液在A595nm，测定其吸光度值太大，影响测定结果。因此，需要将青霉素发酵液，按一定比例进行稀释，根据标准曲线【田，计算出蛋白含量。3结果与分析3．1测定波长的选择按照“2．4乞*管为被测样品，以0。管为空白，进行全波长扫描，测得该标准溶液在595nm下有最大吸收，说明在595am时对蛋白最敏感，测得蛋白准确性最高嘲。3．2线性关系考察通过标准曲线得回归方程为y=O．0039对0．0488，蛋白质含量在0"30lIg／mL范围内成良好线性。3．3准确度和精